表皮生长因子减轻α-鹅膏蕈碱诱导的肝毒性：与水飞蓟宾的比较

《Toxicon》：Epidermal growth factor attenuates α-amanitin–induced hepatotoxicity: a comparison with silibinin

　　

摘要

α-鹅膏蕈碱是毒鹅膏（Amanita phalloides）的主要毒素，会导致暴发性肝衰竭，目前尚无经证实有效的解毒剂。水飞蓟宾是最常用的药物，但其临床获益仍不确定。由于表皮生长因子受体信号传导在α-鹅膏蕈碱损伤过程中被激活，且表皮生长因子（EGF）具有抗氧化和细胞保护特性，我们询问 EGF 是否能保护肝细胞免受α-鹅膏蕈碱的伤害。在 HuH-7 细胞中，EGF（最高 20 μM）和水飞蓟宾（最高 100 μM）均无细胞毒性；在反映代谢活性而非确切存活率的 MTT 测定中，联合用药与 10 μM α-鹅膏蕈碱相比未显著改变信号，而 EGF 以浓度依赖性方式恢复了超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽，并降低了丙二醛水平。在 BALB/c 小鼠中，急性α-鹅膏蕈碱中毒（0.75 mg/kg）分别用 EGF（750 或 1500 μg/kg）、水飞蓟宾（5 mg/kg）或两者联合作为治疗。高剂量 EGF 使血清 AST、ALT、ALP 和 GGT 下降幅度最大，肝脏组织病理损伤评分最低，且肝组织 caspase-3 免疫阳性率最低；在这些终点上，其效果与所测试的单一水飞蓟宾方案相当，且优于 750 μg/kg 剂量。在急性模型的局限性范围内（未评估存活率或测量信号传导），EGF——特别是高剂量——与氧化应激和凋亡减少相关联，减轻了α-鹅膏蕈碱的肝毒性，值得作为鹅膏毒肽中毒的候选疗法进行进一步评估。

引言

含有鹅膏毒肽的蘑菇，主要是毒鹅膏（Amanita phalloides），是全球致命的蘑菇中毒的主要原因，病死率约为 10–20%，且随着治疗延迟而上升（Santi 等，2012；Mengs 等，2012）。主要的肝毒素α-鹅膏蕈碱通过窦状隙有机阴离子转运多肽 OATP1B3 进入肝细胞，抑制 RNA 聚合酶 II，阻断转录和蛋白质合成，从而驱动肝细胞死亡（Letschert 等，2006；Brueckner 和 Cramer，2008）。在具有欺骗性的胃肠道潜伏期后，中毒可进展为急性肝衰竭，此时原位肝移植可能是唯一的救命选择（Yildiz 等，2008）。

在对照研究中，尚无解毒剂被证明完全有效。管理方案包括胃肠道去污、液体复苏和水飞蓟宾，后者是一种来自奶蓟草（Silybum marianum）的黄酮木脂素，可竞争鹅膏毒肽的 OATP 介导的摄取，并具有抗氧化和抗炎活性（Letschert 等，2006；Mengs 等，2012；Gillessen 和 Schmidt，2020）。观察性系列研究显示使用水飞蓟宾的死亡率较低，但治疗方案存在差异，缺乏随机试验，其获益也存在争议（Enjalbert 等，2002；Mengs 等，2012）。在一项受控的小鼠比较中，水飞蓟宾和其他几种候选解毒剂未能限制α-鹅膏蕈碱诱导的肝坏死（Tong 等，2007）。除了转录停滞外，α-鹅膏蕈碱损伤还涉及氧化应激——超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性变化及脂质过氧化——以及 p53 和 caspase-3 依赖性凋亡（Zheleva 等，2007；Magdalan 等，2010），这扩大了治疗靶点，朝向抗氧化和抗凋亡策略发展。

表皮生长因子（EGF）是表皮生长因子受体（EGFR）的原型配体，调控细胞生存、增殖和迁移，并在几种上皮损伤模型中具有细胞保护作用（Shin 等，2023）。在内毒素损伤的肠道上皮细胞中，EGF 恢复了超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽，降低了丙二醛并抑制了 caspase-3（Tang 等，2018）。该通路的受体臂与鹅膏毒肽损伤相关，因为 EGFR 下游的 RAS/RAF/ERK 级联在暴露于α-鹅膏蕈碱的肝细胞中被激活（Kim 等，2022）。然而，补充配体本身的效果尚不清楚，且损伤肝脏中的 EGFR 生物学具有情境依赖性：在扑热息痛诱导的肝损伤中，药理性 EGFR 抑制具有保护作用（Bhushan 等，2016）。因此，EGF 是减轻还是加重α-鹅膏蕈碱的肝毒性仍然是一个未解决的问题。

我们在两个互补系统中评估了 EGF 对抗α-鹅膏蕈碱肝毒性的作用：HuH-7 肝细胞模型（代谢活性及氧化应激标志物 SOD、CAT、GSH 和 MDA）和 BALB/c 小鼠急性中毒模型（血清肝酶、肝脏组织病理学及 caspase-3 免疫组织化学）。水飞蓟宾和 EGF–水飞蓟宾联合用药作为对照，我们询问保护是否具有剂量依赖性。

章节片段

细胞培养

HuH-7 人肝癌细胞（美国标准生物样品库，美国）在补充了 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 链霉素、1% MEM 非必需氨基酸和 1% L-谷氨酰胺的 RPMI-1640 培养基（Gibco, NY, 美国）中，于 37 °C、加湿 5% CO₂ 气氛中培养。

细胞毒性测定

使用 MTT 法（Mosmann，1983）测定代谢活性，并作为代谢活性的指标，仅谨慎地解释为存活率的替代指标；因为 EGF 是

代谢活性（MTT 法）

总体而言，不同条件下的 MTT 信号（代谢活性）存在差异（Kruskal–Wallis H = 85.47, df = 22, p < 0.001; 图 1）。α-鹅膏蕈碱以浓度依赖性方式降低信号，从 1.25 μM 时的 92.4 ± 7.9% 降至 40 μM 时的 68.4 ± 10.4%；经 Bonferroni 校正后，与对照组相比，10 μM 及以上的减少具有统计学意义（10 μM, p = 0.032; 20 μM, p = 0.006; 40 μM, p = 0.001），因此此后使用 10 μM。EGF (0.02–20 μM) 和水飞蓟宾 (12.5–100 μM) 无细胞毒性；该

讨论

在互补的读数中，EGF 与减少的α-鹅膏蕈碱肝毒性相关——HuH-7 细胞中抗氧化标志物恢复，小鼠中血清酶、组织病理损伤和 caspase-3 降低——且效果具有剂量依赖性，高剂量 EGF 提供的保护与所测试的单一水飞蓟宾方案相当。特征化了毒素的体外浓度 - 反应关系（1.25–40 μM），尽管体内研究使用了单一毒素剂量。在 MTT 测定本身中，联合用药

结论

在该急性模型中，EGF——特别是 1500 μg/kg 剂量——与减少的α-鹅膏蕈碱诱导的氧化应激、较低的肝细胞酶泄漏、较低的组织病理损伤和较少的 caspase-3 介导的凋亡相关，其保护作用与水飞蓟宾相当。缺乏机制、剂量 - 反应和存活数据，这些发现是初步的，但它们确定了 EGF 作为鹅膏毒肽中毒值得进一步研究的候选药物。

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伦理批准

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在体外和体内减轻α-鹅膏蕈碱诱导的肝毒性：与水飞蓟宾的比较》，

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致谢

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马尔马拉大学医学院急诊医学系，土耳其伊斯坦布尔