内生细菌和真菌作为多糖来源：生产与表征技术

《Frontiers in Microbiology》：Endophytic bacteria and fungi as a source of polysaccharides: production and characterization techniques

　　

聚合物，主要是多糖（polysaccharides），是一类在生物系统中具有多种结构和功能作用的大分子。近年来，关于多糖，尤其是来源于微生物的胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）的研究引起了极大的关注。这些物质因其生物相容性（biocompatibility）、生物降解性（biodegradability）以及在制药、生物医学和工业领域的广泛应用而备受重视。内生微生物（endophytic microorganisms）生活在健康植物组织内部，是新发现的胞外多糖可持续来源。本文综述了产生多糖的内生细菌和真菌的研究，主要侧重于总结所采用的生产和表征技术，包括提取、纯化和结构分析，涉及色谱（chromatographic）、波谱（spectroscopic）和显微镜（microscopic）技术。此外，文中还包含总结细菌和真菌内生菌多糖特征的表格，以及这些多糖的表征技术和生物活性的表格。通过整合现有见解并识别存在的空白，本综述旨在加深对内生多糖的理解。

1 引言

多糖是由十个以上单糖通过聚合反应形成的高分子量碳水化合物，在生物体内广泛存在，既是能量储存分子，也是细胞膜和细胞壁的结构成分，并参与信号转导和渗透调节等生理过程。多糖具有抗肿瘤、免疫调节、抗炎、抗菌、抗氧化和抗病毒等多种生物活性。微生物多糖因可在受控发酵条件下大规模生产、生产周期短、便于提取、结构多样且具有生物相容性和可降解性，在食品、化妆品、生物医学和工业领域应用广泛。近年来，与植物相关的内生微生物被视为多糖的新兴可持续来源。

2 文献收集策略

该综述通过Scopus、Web of Science、PubMed和Google Scholar等数据库检索，并筛选相关文章的参考文献以补充研究。优先纳入了2019至2026年间发表的关于内生微生物多糖生产、提取、纯化、结构表征和生物活性的研究，特别关注2023至2025年的文献。检索发现，关于真菌内生菌的研究数量多于细菌内生菌，因此综述中真菌实例更为丰富，这也反映出细菌内生菌来源的多糖研究有待加强。

3 微生物多糖的类型

根据产生位置，微生物多糖可分为胞内多糖（intracellular polysaccharides，IPS）、胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）和细胞壁多糖（cell wall polysaccharides，CWPS）。EPS在细胞内合成后分泌至胞外，多为高分子量同型或异型聚合物，因易分离而研究最为广泛。IPS存在于细胞质或细胞结构中，常从真菌菌丝体或子实体中分离，分离难度较大。CWPS是微生物细胞壁的必需组分，与IPS有一定重叠，对维持细胞壁完整性和提供保护具有重要作用。

4 植物内生菌作为结构多样性生物活性化合物的来源

内生菌是在健康植物组织内生存且不引起明显病害症状的微生物，经过长期协同进化与宿主形成互惠关系，可增强宿主防御、胁迫耐受和养分获取能力。内生菌包括细菌、放线菌、支原体和真菌等类型。细菌内生菌主要属于放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes），可产生抗菌、抗炎、抗癌等生物活性代谢产物。放线菌具有菌丝体并产孢子，被看作介于真菌和细菌之间的微生物。真菌内生菌主要为子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota），常见属有Penicillium、Fusarium、Pestalotiopsis和Taxomyces等，能产生多种对宿主有益的次生代谢产物以及具有药用价值的植物化学物质。

5 内生菌来源的多糖：多样性、结构特征和生物学意义

内生微生物是结构多样的胞外多糖的潜在生产者。细菌内生菌产生的EPS多为杂多糖，主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖和糖醛酸组成，分子量范围约为5 kDa至超过400 kDa。例如，Burkholderia sp.产生的EPS具有α-葡聚糖主链和O-6分支，表现出抗菌和益生元活性。许多细菌EPS具有较强抗氧化活性，糖醛酸含量与自由基清除能力相关。真菌内生菌来源的EPS在结构上更多样，分子量范围宽，常见葡萄糖、甘露糖和半乳糖，也含糖醛酸等。许多真菌EPS为富含葡萄糖的β-葡聚糖，糖苷键以β-(1→3)和β-(1→6)为主。真菌EPS表现出抗氧化、免疫刺激、抗炎、抗肿瘤、保肝、促伤口愈合和抗糖尿病等多种活性，部分还具有凝胶形成和保湿性能，适合用于生物医学材料和化妆品。

6 内生菌多糖的生产、提取、纯化和表征

一般流程包括：植物组织表面灭菌，分离内生微生物，通过菌落形态、刚果红琼脂（CRA）和钌红琼脂（RRA）染色及显微观察进行初步筛选，然后在深层发酵和补料分批发酵中生产EPS。发酵液经离心去除菌体，通过热处理或三氯乙酸（TCA）脱蛋白去除杂质，乙醇沉淀获得粗多糖，再经透析去除小分子污染物并冻干得到纯化多糖。发酵条件的优化对EPS产量和结构至关重要。葡萄糖是最常用的最优碳源，但最佳碳源具有菌株特异性；有机氮源如酵母提取物和蛋白胨常可促进EPS合成，较高的碳氮比有利于聚合物积累。pH、温度、通气量、剪切力、盐离子等物理化学条件均影响EPS分泌。温和的胁迫条件可能促进EPS产生。表征方法包括分子量测定、单糖组成分析、糖苷键分析和整体结构解析，通常需要多种互补技术。

7 EPS的分子量分析

分子量影响多糖的理化性质和生物活性。高分子量多糖可形成有序二级结构（如三螺旋），增强免疫调节和抗肿瘤活性；低分子量多糖具有较多的还原端和羟基，抗氧化能力强且更易透过生物膜。常用色谱和质谱方法包括分子排阻色谱（SEC）及其高效变体（HPSEC），可测定数均分子量（M_n）、重均分子量（M_w）和多分散指数（PDI）。SEC与多角度激光光散射联用（SEC-MALS/MALLS）可直接测定绝对分子量，无需校准标准品。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）是一种软电离技术，快速、灵敏，适合分析中低分子量多糖及其寡糖片段。

8 单糖组成分析

单糖组成影响EPS的生物活性。细菌和真菌内生菌多糖在单糖组成、糖苷键和分子量分布上存在差异。常用分析方法有高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测（HPAEC-PAD）、高效液相色谱（HPLC）和气相色谱-质谱联用（GC-MS）。HPAEC-PAD可直接检测无需衍生化的单糖，灵敏度高。HPLC需将多糖经三氟乙酸（TFA）水解后，用示差折光（RI）检测器或PMP衍生化后分析。GC-MS则需将多糖水解产物衍生化为三甲基硅烷（TMS）衍生物，再进行分离检测，同时可用于糖苷键分析。

9 多糖的结构分析

傅里叶变换红外光谱（FT-IR）通过特征吸收峰识别多糖中的官能团，包括O–H伸缩（3,200–3,500 cm^?1）、C–H伸缩（约2,900 cm^?1）、C=O伸缩（约1,720–1,740 cm^?1）、COO^?非对称和对称伸缩（约1,600和1,400 cm^?1）以及C–O–C糖苷键振动（约1,000–1,150 cm^?1）。FT-IR可采用衰减全反射（ATR）法或KBr压片法。核磁共振波谱（NMR）通过一维（¹H、¹³C）和二维（COSY、HSQC、HMBC）技术确定单糖组成、异头构型、糖苷键和连接顺序。X射线衍射（XRD）用于分析多糖的结晶度，通常微生物多糖的衍射峰较宽，表明其主要为无定形结构。

10 内生菌多糖的构效关系

多糖的生物活性与分子量、单糖组成、糖