**氨基酸补充型聚合物纳米凝胶增强单细胞悬液及二维单层细胞培养的冷冻保存效能**

《RSC Applied Polymers》：Amino acid-supplemented polymeric nanogels enhance cryopreservation efficacies in single-cell suspensions and 2D monolayer cell culturesOpen Access

　　

聚合物纳米凝胶是无二甲基亚砜(DMSO)冷冻保护剂的一个实例，已有文献记载其可在冷冻保存过程中调节冰晶相关的膜损伤，同时保持整体生物相容性。基于纳米凝胶的冷冻保护剂的冷冻保存效能很大程度上取决于材料的整体两亲性，并可通过将纳米凝胶的冰重结晶抑制(IRI)效能与氨基酸的渗透保护能力相结合而得到改善。在本研究中，研究人员报道了N,N'-亚甲基双丙烯酰胺交联的聚(维生素B5类似物甲基丙烯酰胺)(poly(B5AMA))纳米凝胶的合成，并补充中性氨基酸以提高多种细胞悬液和二维(2D)细胞培养中的冷冻保存效能。聚合物纳米凝胶通过自由基聚合法合成，具有净中性表面电荷的纳米尺寸颗粒以多种浓度补充氨基酸。研究人员分析了纳米凝胶制剂的理化行为，包括粘度、热学特性和IRI活性。对红细胞进行了溶血百分比和渗透脆性分析，并将纳米凝胶单独与氨基酸补充纳米凝胶制剂的结果进行了比较。研究人员分析了悬浮和单层培养中有核细胞的冷冻保存效能。

**研究背景**

冷冻保存是现代生物学和医学中的关键技术，广泛应用于再生医学、细胞治疗、生殖生物学和生物样本库等领域。二甲基亚砜(DMSO)和甘油作为传统小分子冷冻保护剂(CPA)应用广泛，DMSO可快速穿透细胞并防止渗透休克，甘油则提供优良的膜稳定作用。然而，二者均存在细胞毒性及不同细胞类型间效果差异显著等局限性，推动研究转向低毒高效的替代方案。近年来，富羟基聚合物与纳米颗粒、两性离子、抗冻蛋白、水凝胶等大分子CPA逐渐兴起，主要通过胞外作用与水分子相互作用、干扰氢键网络和冰晶形成来抑制冰重结晶，从而保障冻存过程中的细胞活力。但大分子CPA引起的高渗性渗透应激和膜稳定性问题仍是该领域的主要挑战。将大分子CPA与小分子结合可显著改善细胞活力。中性氨基酸如丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)和甜菜碱(Bet)兼具冰重结晶抑制剂、渗透保护剂和抗氧化剂等多重功能。研究人员前期已证实羟基化聚合物纳米凝胶作为生物相容性冷冻保护平台的潜力，但其效能高度依赖于纳米凝胶的两亲性设计。基于此，研究人员探索在纳米凝胶体系中补充中性氨基酸，以期进一步提升复杂细胞类型及二维(2D)细胞培养的冷冻保存效能。

**研究内容概述**

研究人员通过自由基聚合法合成了N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)交联的聚(维生素B5类似物甲基丙烯酰胺)(poly(B5AMA))纳米凝胶，并以10 mM浓度补充甘氨酸、丙氨酸和甜菜碱，制备NGs-Gly、NGs-Ala和NGs-Bet三种制剂。系统评估了制剂的理化性质、冰重结晶抑制(IRI)活性、热学行为，以及在红细胞(RBC)、骨髓来源成纤维细胞(HS-5)、小鼠乳腺癌细胞(4T1)和人乳腺癌上皮细胞(MDA-MB-231)悬浮体系及HS-5二维单层培养中的冷冻保存效能。

**关键技术方法**

主要技术方法包括：自由基聚合合成纳米凝胶；动态光散射(DLS)和zeta电位分别表征粒径及表面电荷；Linkam冷台冰冻显微镜结合夹层法制备样品评估IRI活性，以平均最大晶粒尺寸(MLGS)为指标；差示扫描量热法(DSC)分析热学行为；红细胞溶血实验和渗透脆性实验分别评估膜完整性与渗透调节能力；锥虫蓝排斥实验和MTS比色法分别评估冻融后细胞膜完整性和代谢活性。细胞系均购自ATCC，包括4T1、MDA-MB-231和HS-5细胞。

**研究结果**

*纳米凝胶的合成与表征*：自由基聚合获得高转化率（B5AMA单体84.9%，交联剂100%），纳米凝胶产率95.2%。DLS显示有效水合直径为92.15±4.85 nm，多分散指数(PDI)为0.29±0.01，zeta电位为5.82±1.31 mV，呈净中性表面电荷。

*氨基酸补充制剂的理化特性*：高浓度氨基酸(100–400 mM)导致冻后细胞活力显著下降（>90%细胞死亡），而10 mM低浓度Ala、Bet和Gly可显著改善HS-5细胞冻后活力；脯氨酸(Pro)无明显效果。氨基酸补充不改变纳米颗粒的粒径、表面电荷及制剂粘度。

*冰重结晶抑制活性*：未补充氨基酸的NGs制剂MLGS为571.9±220.6 μm²，显著低于PBS对照(~1100 μm²)。NGs-Gly表现最优，MLGS降至140.2±27.0 μm²，较NGs降低四倍以上，接近PVA对照(~26 μm²)的水平；NGs-Ala和NGs-Bet分别为419.1±163.4 μm²和391.2±86.6 μm²。

*差示扫描量热分析*：以Bet为模型氨基酸，10 mM Bet的加入未显著改变冻融热流曲线，仅使熔点降低0.5 °C。

*溶血活性*：NGs单独处理的溶血率为41.38±7.26%，NGs-Gly降至29.74±3.11%，为所有制剂中最低；NGs-Ala和NGs-Bet分别为47.48±2.68%和45.53±0.38%，与NGs无显著差异。

*渗透脆性*：补充氨基酸的制剂在所有NaCl浓度范围(0.10%–0.90%)内均未观察到溶血，平均红细胞脆性(MCF)呈"未检出"状态；而NGs单独组MCF为3 g L^-1，与新鲜RBC相当，表明氨基酸显著增强了冻存RBC的渗透调节能力。

*哺乳动物细胞冷冻保存（悬浮体系）*：10% NGs制剂的冷冻保存效能呈浓度和细胞系依赖性。补充氨基酸使MDA-MB-231和4T1细胞冻后完整细胞数提高约1.5倍；NGs-Ala和NGs-Gly使MDA-MB-231细胞代谢活性分别提升至80.41±6.63%和77.21±10.37%。对HS-5细胞，氨基酸补充使活细胞数从1百万增至约2百万每毫升，代谢活性从~40%提升至>80%。补充抗氧化剂2-磷酸-L-抗坏血酸三钠盐(PAA)后，NGs-Bet和NGs-Gly制剂的活细胞数分别从1.5增至3百万和2增至2.7百万每毫升，代谢活性>97%，与DMSO对照相当。

*二维单层细胞培养冷冻保存*：DMSO在二维培养中的效能显著下降（54.70%±11.66%）。NGs制剂表现与DMSO相当（代谢活性~60%）。NGs-Ala表现最佳，活细胞数较NGs提高约2.5倍，代谢活性达92.63%±6.62%，接近未冻存对照；NGs-Gly在二维培养中表现不佳，NGs-Bet持续表现较差。形态学观察显示NGs制剂冻后保持HS-5细胞正常梭形形态且无表型改变，而DMSO组呈现球形表型，提示细胞膜损伤。

**讨论与结论**

讨论部分指出，Gly在悬浮细胞体系中的优异表现归因于其高水合能力和小分子尺寸，与纳米凝胶的IRI活性协同形成致密有序的水合层，有效阻断冰晶生长位点并减少冰晶诱导的膜破坏；Ala凭借两亲性和膜稳定作用在二维培养中表现突出，提示其保护机制不同于IRI；Bet则通过两性离子特性与界面水分子产生强偶极相互作用，提供中等程度的IRI增强。部分制剂（NGs-Bet、NGs-Gly）的冷冻保存效果受活性氧(ROS)产生所限，补充PAA抗氧化剂后细胞损伤显著降低。研究结论指出，氨基酸补充型纳米凝胶制剂在悬浮细胞体系中，NGs-Gly和NGs-Ala维持了更高的活细胞数和代谢活性；在二维单层培养中，NGs-Ala的冷冻保存效能优于其他制剂且超过DMSO对照。本研究为无DMSO冷冻保护剂的理性设计提供了新思路，未来研究方向将评估长期冷冻保存效能及三维(3D)球体培养模型。