TGF-β1直接致敏辣椒素敏感性肺迷走神经元促进气道高敏反应

《Acta Physiologica》：TGF-β1 Directly Sensitizes Capsaicin-Sensitive Lung Vagal Neurons to Promote Airway Hypersensitivity

　　

摘要专业翻译 目的： 转化生长因子-β1（TGF-β1）是一种多效性细胞因子，参与哮喘等炎性气道疾病的发病机制。气道高敏反应（AHS）源于辣椒素敏感性肺迷走（CSLV）传入神经的致敏，是此类气道疾病的标志性特征。尽管TGF-β1在气道疾病中的免疫调节作用已有充分文献记载，但其对肺感觉神经元的影响尚未被探索。鉴于TGF-β1可致敏背根神经节（DRG）神经元（CSLV神经元的躯体对应物），研究人员探究了TGF-β1是否能够致敏CSLV传入神经，从而促进AHS。 方法： 采用雄性Brown-Norway大鼠，通过呼吸模式和单纤维记录技术，在体内（in vivo）研究TGF-β1对气道反射和CSLV传入神经兴奋性的影响；通过Ca2+成像和免疫荧光技术，在体外（in vitro）研究其对分离的CSLV神经元的直接作用。 结果： 气管内滴注TGF-β1增强了辣椒素注射诱发的呼吸暂停反应及CSLV传入神经的纤维活动。致敏效应在TGF-β1滴注后20分钟出现，90分钟后恢复至基线水平。在分离的CSLV神经元中，灌注TGF-β1增强了辣椒素和α,β-亚甲基ATP（α,β-mATP）诱发的Ca2+瞬变，表明其具有直接致敏效应。免疫荧光证实了这些神经元中TGF-β受体的表达。药理学抑制TGF-β受体I（TGF-βRI）、Smad3或瞬时受体电位锚蛋白1（TRPA1）、清除活性氧（ROS）以及TRPA1靶向小干扰RNA（siRNA）均减弱了TGF-β1诱导的辣椒素诱发反应增强。 结论： TGF-β1增强CSLV传入神经兴奋性并直接致敏CSLV神经元，从而促进AHS。细胞致敏效应涉及TGF-βRI、Smad3、ROS和TRPA1相关机制。

论文解读

一、研究背景与科学问题

炎性气道疾病（包括哮喘、慢性阻塞性肺疾病（COPD）和肺纤维化）日益被认为是由复杂的神经-免疫相互作用驱动的疾病，其中肺感觉神经的失调在疾病症状和病理生理中发挥关键作用。转化生长因子-β1（TGF-β1）是一种多效性细胞因子，在免疫调节、组织重塑和纤维化中具有公认的作用。已有研究在哮喘、COPD和特发性肺纤维化患者的支气管肺泡灌洗液（BALF）、气道组织和痰液中检测到TGF-β1水平升高，动物模型中也有一致发现。实验证据表明，增强的肺TGF-β1信号传导可促进气道重塑和气道高反应性。

然而，尽管TGF-β1与气道疾病的炎症和结构成分之间的关联已有大量证据，但其在气道功能神经调控中的作用仍未被充分阐明。辣椒素敏感性肺迷走（CSLV）传入神经是支配整个呼吸道的迷走传入神经中主要的化学敏感性感觉神经元群体，负责启动咳嗽和支气管收缩等气道反射。CSLV传入神经的致敏可导致气道反射反应过度增强，构成气道高敏反应（AHS）的基础——这是哮喘、COPD和肺纤维化等多种气道疾病常见且具有临床意义的特征，常表现为咳嗽高敏。

值得注意的是，已有研究显示TGF-β1可直接致敏背根神经节（DRG）神经元（CSLV神经元的躯体对应物），并在多种疼痛模型中促成痛觉过敏。DRG神经元和CSLV神经元作为外周感觉神经系统中的功能对应物，共享关键的分子和生理特征，包括化学敏感性和瞬时受体电位（TRP）通道的表达。基于这些观察，研究人员提出假设：TGF-β1可能致敏CSLV传入神经并促进AHS。本研究旨在：（1）确定TGF-β1是否增强麻醉大鼠中辣椒素诱发的气道反射反应；（2）评估TGF-β1对CSLV传入神经在体兴奋性的影响；（3）检验TGF-β1是否直接致敏分离的CSLV神经元；（4）阐明TGF-β1诱导神经元致敏的细胞内信号机制。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员使用雄性Brown-Norway大鼠开展实验，共使用56只大鼠，其中28只用于在体研究，26只用于体外研究，2只用于免疫荧光染色。在体实验采用气管内滴注TGF-β1（22 μg/0.1 mL）或载体（PBS），通过呼吸模式记录测量辣椒素诱发（经右心房注射）的呼吸暂停反应，并通过单纤维记录技术记录CSLV传入神经的纤维活动（FA）。体外实验采用荧光逆行示踪剂DiI注入肺内标记迷走支气管肺神经元，分离结节状神经节和颈静脉神经节进行原代培养，通过Ca²⁺成像技术（Fura-2 AM荧光探针）测量辣椒素和α,β-亚甲基ATP（α,β-mATP）诱发的Ca²⁺瞬变，并通过免疫荧光检测TGF-β受体表达。机制研究采用药理学抑制剂（SD-208抑制TGF-βRI、SIS3抑制Smad3、N-乙酰半胱氨酸（NAC）清除ROS、HC-030031拮抗TRPA1）以及TRPA1靶向小干扰RNA（siRNA）转染，并通过RT-qPCR验证基因敲低效率。

三、研究结果

3.1 在体研究

3.1.1 TGF-β1增强麻醉自发呼吸大鼠中CSLV传入神经介导的呼吸暂停反射

通过测量气管内滴注TGF-β1或载体前后不同时间点（滴注前10分钟及滴注后20、60、90分钟）辣椒素诱发的呼吸暂停反应，研究发现TGF-β1滴注后20分钟，辣椒素诱发的呼吸暂停反应显著增强（呼吸暂停比值：载体组2.24 ± 0.61 vs. TGF-β1组5.82 ± 1.07，p < 0.05），90分钟后逐渐恢复至基线水平。载体滴注在各时间点均未显著改变辣椒素诱发的呼吸暂停反应。基线平均动脉血压和心率在两组间各时间点均无显著差异，表明TGF-β1气管内滴注不改变基线心血管状态。

3.1.2 TGF-β1增加麻醉人工通气大鼠中CSLV传入神经的兴奋性

采用单纤维记录技术，在开胸人工通气大鼠中记录辣椒素诱发的CSLV传入神经纤维活动。TGF-β1滴注后20分钟，辣椒素诱发的ΔFA显著升高（载体组：0.75 ± 0.12 vs. TGF-β1组：1.88 ± 0.29，p < 0.01），90分钟后恢复。基线纤维活动和气管压力（Ptr）在两组间无差异。该时间过程与呼吸暂停反应的增强时间过程一致，表明TGF-β1致敏CSLV传入神经并促成AHS。

3.2 体外研究

3.2.1 TGF-β1灌注增强分离CSLV神经元中辣椒素和α,β-mATP诱发的Ca²⁺瞬变

在DiI标记的分离CSLV神经元中，TGF-β1（7.5 ng/mL，20分钟）灌注后15分钟，辣椒素（0.1 μM）诱发的Ca²⁺瞬变显著增强（倍数变化：载体组1.39 ± 0.22 vs. TGF-β1组2.61 ± 0.48，p < 0.05）。TGF-β1同样增强了α,β-mATP（2.0 μM，P2X2/3激动剂）诱发的Ca²⁺瞬变（载体组1.01 ± 0.07 vs. TGF-β1组1.28 ± 0.11，p < 0.05），表明TGF-β1的致敏效应不仅限于辣椒素（TRPV1）介导的反应，还扩展至嘌呤能受体介导的反应。

3.2.2 TGF-βRI和TGF-βRII在分离CSLV神经元中表达

通过免疫荧光检测，在分离的迷走感觉神经元中，34.6%（150/433）被DiI标记；其中80.7%（121/150）呈TRPV1阳性，被确认为CSLV神经元。TGF-βRI和TGF-βRII分别在这些TRPV1阳性CSLV神经元中的84.6%（55/65）和87.5%（49/56）表达。两种受体的存在为TGF-β1直接神经元致敏提供了解剖学和分子学基础。

3.2.3 TGF-βRI、Smad3、ROS和TRPA1参与TGF-β1诱导的CSLV神经元致敏

TGF-βRI抑制剂SD-208（0.1 μM）预处理完全消除了TGF-β1诱导的辣椒素诱发Ca²⁺瞬变增强（载体组2.73 ± 0.97 vs. SD-208组1.03 ± 0.23，p < 0.05）。Smad3抑制剂SIS3（0.5 μM）预处理显著减弱了该增强效应（载体组3.38 ± 1.01 vs. SIS3组0.93 ± 0.19，p < 0.05）。ROS清除剂NAC（2 mM）预处理同样显著抑制了增强效应（载体组3.80 ± 0.97 vs. NAC组1.47 ± 0.34，p < 0.05）。TRPA1拮抗剂HC-030031（10 μM）预处理显著减弱了增强效应（载体组2.57 ± 0.60 vs. HC-030031组1.58 ± 0.57，p < 0.05）。TRPA1靶向siRNA敲低TRPA1表达后，TGF-β1诱导的增强效应被显著抑制（阴性对照3.58 ± 1.09 vs. siTRPA1组1.13 ± 0.15，p < 0.05），RT-qPCR验证了siRNA介导的TRPA1 mRNA下调效率。这些互补的药理学和遗传学证据支持TGF-βRI、Smad3、ROS和TRPA1参与TGF-β1诱导的CSLV神经元致敏。

四、讨论与结论总结

讨论部分指出，TGF-β1增强辣椒素诱发的呼吸暂停反射和CSLV传入神经纤维活动，其快速起效（20分钟）的时间过程不太可能由上皮-间质转化或成纤维细胞增殖等需要较长时间的过程介导，且初步实验未观察到TGF-β1处理后BALF中炎性细胞募集增加，提示非神经元细胞的间接贡献可能性较低。体外实验在缺乏上皮细胞和炎性细胞的条件下证实了TGF-β1的直接神经元致敏作用。

关于信号机制，TGF-βRI激活后，Smad3作为经典通路参与致敏效应，可能通过抑制A型钾电流导致膜去极化和神经元兴奋性增强。研究还发现ROS参与致敏过程，ROS可通过激活TRPA1通道促进CSLV传入神经的敏感性。TRPA1阻断或敲低显著减弱TGF-β1诱导的增强效应，其机制可能与膜电导或静息膜电位改变有关，也可能涉及TRPA1与TRPV1之间的功能性相互作用。研究还讨论了CSLV神经元与分子定义的Npy2r表达呼吸迷走神经元群体的可能重叠，以及结节状神经节中高表达Nav1.8和TRPV1的伤害感受器样神经元群体同时表达Trpa1和Tgfbr1基因的转录组学联系。

研究存在四项主要局限性：仅使用外源性TGF-β1、无法完全排除在体条件下非神经元细胞的间接贡献、药理学抑制剂可能存在脱靶效应、仅使用雄性大鼠。

结论： 综上所述，TGF-β1在体内增强CSLV传入神经兴奋性，并在体外直接致敏分离的CSLV神经元，从而促进AHS。细胞致敏效应涉及TGF-βRI、Smad3、ROS和TRPA1相关机制，但各组分间的精确信号顺序及TRPA1与TRPV1的功能关系仍有待确定。这些发现将CSLV神经元确定为TGF-β1的直接细胞靶点，并揭示了一种潜在的神经元机制，TGF-β1可能通过该机制促成炎性气道疾病中肺感觉功能的失调。