髓系细胞糖皮质激素受体信号协调炎症消退与肌肉修复

《Advanced Science》：Glucocorticoid Receptor Signaling in Myeloid Cells Orchestrates Inflammation Resolution and Muscle Repair

　　

糖皮质激素(glucocorticoids, GCs)是炎症和组织修复的关键调节因子，但其在肌肉再生中的精确作用仍不完全清楚。本研究探讨了髓系特异性糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)失活对急性损伤后巨噬细胞动力学和肌肉干细胞功能的影响。研究人员证明，髓系细胞中GR缺失导致巨噬细胞积累增加，这是由增殖和募集的改变所驱动，而在稳态条件下不影响纤维脂肪祖细胞分化或卫星细胞增殖与分化。早期再生阶段的转录组学和顺反子组学(cistrome)分析揭示，GR直接调节髓系细胞中涉及细胞周期控制的基因网络。重要的是，在促炎期给予地塞米松(dexamethasone, Dex)会通过损害单核细胞向巨噬细胞转变并以髓系GR依赖性方式促进巨噬细胞增殖，从而显著延迟肌肉再生，最终减少卫星细胞增殖和肌生成。相反，在抗炎期给予地塞米松治疗对肌肉恢复影响有限。综上所述，研究结果揭示了髓系细胞中GR信号在协调肌肉修复过程中炎症消退和干细胞功能方面的关键时间性作用，并强调了糖皮质激素在再生背景中作用的复杂性。

骨骼肌损伤是常见的临床挑战，严重影响活动能力和生活质量。肌肉再生依赖于肌肉干细胞即卫星细胞(satellite cells, SCs)与周围微环境的精密协调，其中巨噬细胞等免疫细胞与SC之间的串扰尤为关键。糖皮质激素(glucocorticoids, GCs)是损伤后下丘脑-垂体-肾上腺轴激活产生的重要抗炎激素，广泛用于治疗炎性疾病，但其在肌肉再生中的具体作用尚存争议。尽管已知糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)在巨噬细胞中驱动抗炎和促消退表型，然而GR信号如何塑造巨噬细胞稳态并进而影响肌肉干细胞动态，其分子机制仍不明确。针对这一空白，研究人员构建了髓系特异性GR敲除小鼠(GRLysm?/?)，结合药理学干预、基因组学及蛋白质组学手段，系统阐明了GR在肌肉修复不同阶段对巨噬细胞和肌生成的时序性调控作用。该研究发表于《Advanced Science》，揭示了GC在再生背景下作用的复杂性，为临床合理使用糖皮质激素提供了重要理论依据。

研究人员采用的主要关键技术方法包括：1）利用Lysm-Cre工具小鼠与GRflox/flox小鼠杂交获得髓系特异性GR敲除小鼠，并通过心脏毒素(cardiotoxin, CTX)注射建立胫骨前肌(tibialis anterior, TA)急性损伤模型；2）通过荧光激活细胞分选(FACS)分离损伤肌肉中的CD11b+髓系细胞，进行bulk RNA测序(RNA-seq)和CUT&RUN分析（检测GR、H3K4me3、H3K27ac的染色质结合谱）；3）采用免疫沉淀结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)鉴定GR相互作用蛋白；4）结合流式细胞术、免疫荧光染色和组织学分析评估免疫细胞动态及肌肉再生指标。样本均来自15周龄雄性小鼠，无人类队列。

**2.1 髓系细胞中的GR调控骨骼肌再生过程中的巨噬细胞增殖与存活**
通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析发现GR在再生肌肉的多个髓系群体中高表达。免疫荧光和caspase活性检测显示，GR缺陷导致2天损伤时KI67+增殖巨噬细胞比例降低超过两倍，同时γH2AX阳性细胞和caspase 3/7活性显著下降，表明GR通过促进DNA双链断裂形成和凋亡参与细胞周期与存活调控。尽管增殖减少，7天时GR缺陷肌肉中仍出现巨噬细胞积累，提示其与局部增殖解耦联，而可能与存活增强和募集改变有关。

**2.2 髓系GR缺陷对卫星细胞和纤维脂肪祖细胞动态影响有限**
通过PAX7和MYOG免疫荧光染色、中心核纤维计数及横截面积测量，发现7天和28天时SC数量、增殖、分化以及肌纤维形态在对照和GRLysm?/?小鼠间均无显著差异。Masson三色染色和COL4检测亦显示纤维化程度相当，表明内源性GC水平下，髓系GR对核心肌源程序和脂肪纤维化命运决定并非必需。

**2.3 转录组分析揭示髓系细胞中GR依赖性基因网络**
对7天损伤后FACS分选的CD11b+细胞进行RNA-seq，鉴定出668个差异表达基因，富集于细胞增殖和基因组组织相关通路。CUT&RUN分析发现GR主要结合远端增强子，约45%的结合位点含有经典糖皮质激素反应元件(GRE)。然而，GR直接结合基因与差异表达基因仅重叠124个，富集于细胞外基质组织和发育过程，提示细胞周期缺陷并非GR直接转录调控所致。GR免疫沉淀质谱鉴定出23个互作蛋白，包括HSPA8、NFKB1等，其中HSPA8富集最显著，暗示GR在髓系细胞中可能处于低亲和力非经典构象，通过蛋白互作或非基因组机制发挥功能。

**2.4 抗炎期地塞米松给药对肌肉再生影响有限**
在4、5、6天损伤期腹腔注射地塞米松(Dex)，组织学和流式分析显示7天时肌肉再生程度、坏死纤维比例及髓系细胞组成在Dex和载体处理组之间无显著差异，仅观察到不表达脂滴标记Perilipin的未知膜泡状结构，表明短期激活GR信号不干扰炎症消退期修复进程。

**2.5 促炎期地塞米松给药以髓系GR依赖方式损害肌肉再生**
在0、1、2天损伤期给予Dex，4天和7天时出现持续坏死纤维和过度基质反应，炎症清除延迟。流式分析显示2天时巨噬细胞比例下降，提示单核细胞向巨噬细胞转变受阻；4天时中性粒细胞增多；7天时CD45+细胞达到约35%，伴随CD206+巨噬细胞积累。RNA-seq显示Dex处理改变了细胞运动和血管重塑相关基因表达，如Mmp9、Col1a1、Nrp2等。部分效应如后期中性粒细胞再募集在GR缺陷小鼠中依然存在，说明存在GR非依赖机制。

**2.6 合成糖皮质激素治疗揭示巨噬细胞与卫星细胞间的GR介导串扰**
Dex处理使对照小鼠巨噬细胞增殖率加倍，但在GRLysm?/?小鼠中完全消失，且CD163+驻留巨噬细胞不增殖，证明Dex促进募集巨噬细胞增殖是GR依赖的。同时，Dex显著抑制PAX7+卫星细胞增殖，并减少7天和28天时中心核肌纤维数量及横截面积，这些表型在GR缺陷小鼠中被消除。RNA-seq分析显示，Dex处理下GR缺失导致72个基因上调和47个基因下调，涉及免疫应答、抗菌活性和脂质代谢等通路，其中Slc15a2、Gzma、Cd36等基因诱导强烈，而Cfb、Mfap4等被抑制。

**讨论总结**
本研究表明，在生理糖皮质激素水平下，髓系GR对肌肉再生的最终结局并非必需，但深刻调控巨噬细胞增殖、存活和基因组完整性。GR并不直接调控经典细胞周期基因，而是通过间接转录级联和蛋白相互作用网络实现功能，尤其是与HSPA8的结合提示了一种非典型GR构象。药理学激活揭示了一个狭窄的治疗时间窗：早期Dex暴露通过髓系GR促进巨噬细胞增殖、抑制卫星细胞活性，并损害肌纤维肥大，而抗炎期给药则无明显影响。此外，Dex的一些效应如持续髓系积累和延迟坏死清除不依赖髓系GR，提示存在其他细胞群或固醇响应机制。这些发现强调GR信号的时间和环境依赖性，并呼吁在再生性疾病中重新审视糖皮质激素的临床应用策略。

**研究结论翻译**
综上所述，该研究揭示了髓系GR信号通过复杂的转录程序调节巨噬细胞动态及巨噬细胞-卫星细胞间的通讯，同时，其他GR非依赖机制也参与糖皮质激素对肌肉修复的调节作用。进一步地，该研究鉴定出一条依赖于GR的细胞间通讯轴，该轴有助于协调炎症消退与干细胞功能。这些发现强调了糖皮质激素信号的时间性与环境依赖性，并提示在再生性疾病的治疗中需重新考虑其应用。