《Scientia Horticulturae》：Integrated metabolome and transcriptome analysis elucidates reproductive functional divergence and regulatory mechanisms underlying the distinct spatial distribution of female flowers in monoecious figs
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榕属（Ficus）植物与其传粉榕小蜂形成了高度特化的互惠共生关系。榕树完全依赖其专性传粉小蜂完成授粉，而榕小蜂仅能在榕果（隐头花序）内完成其生殖周期。然而，榕树种子生产和传粉者后代发育均依赖于雌雄同株榕果内同一批雌花资源，这导致双方在生殖资源分配
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榕属（Ficus）植物与其传粉榕小蜂形成了高度特化的互惠共生关系。榕树完全依赖其专性传粉小蜂完成授粉，而榕小蜂仅能在榕果（隐头花序）内完成其生殖周期。然而，榕树种子生产和传粉者后代发育均依赖于雌雄同株榕果内同一批雌花资源，这导致双方在生殖资源分配上产生竞争。目前，雌花功能分化的内在调控机制仍知之甚少。为填补这一空白，本研究整合了雌雄同株榕树物种——大果榕（Ficus hookeriana）的转录组学与代谢组学分析，系统研究了在雌前期（pre-female phase）、雌花期（female phase）和花间期（inter-floral phase）三个发育阶段中，具有不同生殖功能和空间分布的雌花在分子及代谢层面的差异。结果表明：在雌前期，空间分布不同的雌花在核苷酸代谢（nucleotide metabolism）相关过程中表现出差异，提示与生殖功能分化相关的分子程序存在早期分歧。在雌花期，传粉者的进入与类黄酮生物合成（flavonoid biosynthesis）相关代谢物及基因表达模式的空间变异相关联，这可能解释了雌花间防御相关化学特征存在的个体差异。在花间期，三羧酸（TCA）循环途径中代谢物的差异积累和基因表达的变化提示能量代谢与碳资源利用发生改变，可能有助于种子发育与瘿花形成之间的平衡。本研究系统阐明了雌雄同株榕树中与生殖资源分配相关的阶段特异性代谢和转录变异，为雌花功能分化的分子基础提供了组学层面的见解，并深化了对植物–昆虫互惠互作相关代谢过程的理解。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
榕属（Ficus）植物与传粉榕小蜂之间存在着高度特化的专性互惠共生关系。榕树依赖专性传粉小蜂完成授粉，而榕小蜂仅能在榕果内部完成其生殖周期。榕果本质上是一个近乎完全封闭的隐头花序（syconium），其内部雌花是榕树种子生产和榕小蜂后代发育共同依赖的生殖资源。在雌雄同株榕树中，双方依赖同一批雌花完成各自繁殖，由此形成了对有限生殖资源的激烈竞争。过度开发雌花资源可能破坏甚至瓦解整个共生系统的稳定性。
雌雄同株榕果的发育可分为五个连续阶段：雌前期（雌花未成熟、苞片紧闭）、雌花期（传粉小蜂进入授粉产卵）、花间期（雌花分化为种子花或瘿花）、雄花期（雄花成熟、小蜂后代携带花粉离开）和花后期（榕果成熟脱落）。此前生态学研究表明，雌雄同株榕果中靠近果腔的雌花更易形成瘿花，而靠近果壁的雌花更倾向于产生种子。然而，这种空间分化究竟主要由传粉者行为决定，还是由寄主榕树的内在生理调控决定，尚不明确；其分子机制也极少被研究。以往对雌花生殖分化的研究多集中于形态学性状，分子层面的研究十分有限。因此，该研究旨在通过整合代谢组学和转录组学方法，系统揭示雌雄同株榕树中空间分布不同的雌花在生殖功能分化过程中的分子与代谢调控机制。
二、研究内容与主要结论
研究人员以雌雄同株榕树物种大果榕（Ficus hookeriana）为研究对象，样本采集自中国云南省昆明市（北纬25°6′，东经102°44′，平均海拔1907 m），采集时间为2023年9月至11月，材料取自栽培树木，共使用三株大果榕作为独立生物学来源。研究人员比较了雌前期、雌花期和花间期三个发育阶段中，位于果腔层（cavity-layer, CL）和果壁层（wall-layer, WL）的雌花在基因表达和代谢谱上的差异。研究结果表明，空间分离的雌花经历了不同的发育轨迹并呈现不同的代谢谱，提示分子和代谢状态的空间变异可能与后续的生殖分化相关。结合此前生态学观察（腔层雌花多形成瘿花，壁层雌花主要产生种子），本研究发现的不同分子与代谢特征提示不同空间位置的雌花可能具有不同的发育轨迹和代谢状态，为理解榕果内空间异质性与生殖分化的关联提供了新见解，并为研究榕树–榕小蜂互作中种子–瘿花分配模式提供了候选分子通路。
三、主要关键技术方法
该研究采用了以下主要技术方法：非靶向代谢组学分析（与广州基迪奥生物科技有限公司合作，采用UHPLC-MS/MS平台，涵盖正负离子两种电离模式）；转录组测序分析（基于Illumina NovaSeq 6000平台，采用从头组装策略，共18个样本、6个实验组、每组3个生物学重复）；整合转录组与代谢组联合分析（基于KEGG通路共富集分析和Pearson相关性分析）；以及RT-qPCR验证实验。样本采集策略为：雌前期选取苞片未开放、直径约1 cm的榕果；雌花期通过观察苞片松动并验证传粉小蜂进入行为确定；花间期则为雌花期第一天有小蜂进入并继续发育一周的榕果。
四、研究结果
4.1 雌花形态学观察
显微观察发现，不同空间分布的雌花在子房和花柱形态上存在显著差异。雌前期，腔层雌花呈椭圆形子房、短而粗壮的花柱和伞形柱头；壁层雌花则呈圆形子房、细长花柱和二叉状柱头。雌花期，腔层雌花子房逐渐增大形成明显中央隆起，柱头呈喇叭状展开；壁层雌花子房无明显增大，二叉柱头闭合且花柱显著伸长。花间期，腔层雌花子房持续膨大，子房和花柱颜色加深，柱头开始枯萎；壁层雌花子房也显著增大，柱头同样开始枯萎。
4.2 代谢组学分析
共鉴定出2256种代谢物，分为16类，以脂类化合物（651种）、含氮化合物（326种）、色素和类黄酮（173种）为主。雌前期壁层与腔层比较（PP-WL vs PP-CL）鉴定出140个差异积累代谢物（DAMs），雌花期（FP-WL vs FP-CL）鉴定出185个，花间期（IP-WL vs IP-CL）鉴定出176个。维恩分析显示6组间共有6个共同表达的DAMs，壁层雌花有77个特有DAMs，腔层雌花有82个特有DAMs。
4.3 KEGG通路富集分析
雌前期DAMs显著富集于硫代葡萄糖苷生物合成、2-氧代羧酸代谢、嘌呤代谢和氨酰-tRNA生物合成等通路；雌花期主要涉及核苷酸代谢、苯丙氨酸代谢、ABC转运蛋白和嘌呤代谢；花间期主要涉及核苷酸代谢、嘌呤代谢、柠檬酸循环（TCA循环）和ABC转运蛋白。
4.4 转录组测序与DEGs分析
共获得92,159个unigenes，N50长度为2060 bp，平均长度为1166 bp，BUSCO完整度为72.64%。共鉴定出61,217个差异表达基因（DEGs）：雌前期15,706个（上调11,374个，下调4332个），雌花期5792个（上调2845个，下调2947个），花间期39,719个（上调25,349个，下调14,370个）。维恩分析显示6组间共有7152个共同DEGs，壁层雌花有8910个特有DEGs，腔层雌花有20,682个特有DEGs。
4.5 DEGs功能注释分析
GO富集分析显示：雌前期DEGs主要涉及蛋白水解、氨基酸代谢和甜菜碱代谢等生物过程；雌花期主要富集于氧化还原酶活性和辅酶结合等分子功能；花间期主要涉及蛋白结合和GTPase活性等分子功能。KEGG富集分析显示：雌前期以不饱和脂肪酸、脂肪酸代谢和脂肪酸降解最为显著；雌花期以类黄酮生物合成、色氨酸代谢和苯丙烷生物合成富集程度最高；花间期以泛素介导的蛋白水解、剪接体和真核生物核糖体生物合成最为显著。
4.6 转录组与代谢组联合分析
联合分析显示：雌前期显著富集于核苷酸代谢、谷胱甘肽代谢和嘌呤代谢；雌花期显著富集于类黄酮生物合成、苯丙烷生物合成和托烷、哌啶及吡啶生物碱生物合成；花间期显著富集于柠檬酸循环（TCA循环）、嘌呤代谢和ABC转运蛋白。
4.7 核苷酸代谢通路分析
雌前期，腔层雌花中黄嘌呤积累较多，与guaD、punA和XDH基因相关；壁层雌花中鸟苷和腺苷积累与punA基因相关，胞嘧啶积累与udk、NT5C3和CMPK1基因相关。腔层雌花中核苷酸代谢相关DEGs和DAMs差异更为广泛。
4.8 类黄酮生物合成通路分析
雌花期，壁层雌花中绿原酸显著积累，与HCT和CYP98A基因表达相关；腔层雌花中CHS、CYP75B1、DFR和CYP73A等基因表达上调，伴随木犀草素和芹菜素积累增加。LAR在腔层雌花中高表达，(+)-儿茶素在腔层中相对丰度更高。
4.9 柠檬酸循环（TCA循环）通路分析
花间期，壁层雌花中柠檬酸和顺乌头酸显著积累，而ACO、IDH1/3和OGDH等关键TCA循环基因转录水平相对较低，提示代谢物积累不仅由转录丰度决定，还受代谢通量、底物可用性和组织特异性调控影响。
4.10 RT-qPCR验证
选取9个与代谢通路密切相关的DEGs进行RT-qPCR验证，结果与RNA-seq的FPKM值基本一致，确认了转录组数据的可靠性。
五、讨论与结论
本研究表明，榕果内不同空间位置的雌花在形态、代谢和转录水平上均表现出显著差异。腔层雌花富集有机酸、酚酸和含氮化合物，壁层雌花积累更多酯类、肽类和氨基酸。在雌前期，核苷酸代谢的差异提示空间分离的雌花在早期发育中具有不同的代谢特征和发育活性。在雌花期，类黄酮代谢的空间分化可能反映雌花在榕小蜂进入和产卵过程中对互作相关刺激的生理响应差异。在花间期，TCA循环的差异提示不同空间位置雌花在能量代谢和碳资源利用上存在组织特异性调控。这些发现系统揭示了雌雄同株榕树雌花生殖功能分化的分子和代谢基础，为理解榕树–榕小蜂互惠共生系统的稳定性维持机制提供了新的组学见解，并为后续深入研究种子–瘿花资源分配模式提供了候选分子通路。
