评估深度学习区分野生与栽培葡萄花粉的潜力

《Review of Palaeobotany and Palynology》：Assessing the potential of deep learning to distinguish wild and domesticated grapevine pollen

　　

本研究旨在评估深度学习区分野生与栽培葡萄花粉的潜力。基于人工智能的自动化流程生成了超过20,000张葡萄花粉图像。分类卷积神经网络（Convolutional Neural Network, CNN）模型无法区分野生与栽培葡萄的可育花粉，但能够在一定程度上区分不同个体。花粉大小和形态特征的重叠阻碍了亚种水平的鉴别。

本研究以葡萄属为对象，探讨深度学习在孢粉学亚种鉴别中的可行性与局限性。葡萄（Vitis vinifera）是地中海地区的重要经济作物，其栽培亚种Vitis vinifera subsp. vinifera由野生亚种Vitis vinifera subsp. sylvestris在约8000至6000年前驯化而来。在考古和古生态记录中，区分这两个亚种对理解葡萄驯化历史、酿酒技术传播及人类活动具有重要意义。然而，葡萄叶片、果实和种子等大化石并非普遍保存，而花粉则能在沉积物中广泛保存，是重建过去植被与人类活动的关键载体。但人类专家无法通过形态特征区分野生与栽培葡萄所产生的一种花粉形态型——三孔沟可育形态型（tricolporate fertile morphotype）。此外，葡萄花粉在孢粉组合中丰度极低，加之以往研究常忽略葡萄产生的另一种无孔不育形态型（inaperturate sterile morphotype），导致基于花粉的葡萄亚种鉴别长期无法实现。近年来，基于卷积神经网络（Convolutional Neural Network, CNN）的图像分析技术已在化石花粉分类中展现出高精度潜力，因此研究人员尝试评估CNN区分野生与栽培葡萄花粉的能力，并探索花粉大小和产量能否作为补充鉴别信号。

研究人员利用来自法国Vassal-Montpellier葡萄资源中心（INRAE, SupAgro）的26份葡萄个体花粉样本，其中10个野生个体和10个栽培个体仅产生三孔沟可育花粉，用于构建分类模型；另4个野生个体和2个栽培个体产生无孔不育花粉，用于大小与产量分析。通过自动化图像采集和处理，研究生成超过20,000张花粉图像，构建了“1-pollen/1-image”和“1-pollen/4-images”两种数据集，并采用ResNet152模型进行野生与栽培二分类。结果显示，当训练与测试集来自相同个体时（设计A），模型准确率可达64.7%，说明能部分区分个体；但当测试集完全来自未训练过的个体时（设计B），准确率降至约51%，接近随机水平，表明模型未能学习到可跨个体泛化的亚种特异性特征。花粉大小和产量分析显示，两亚种花粉大小无显著差异，每花产量虽有边缘差异但重叠明显。因此，基于光学显微镜图像和标准CNN的方法无法可靠区分野生与栽培葡萄的可育花粉。该研究提供了一个评估AI孢粉学方法可行性的重要范例，并提示需要更高分辨率成像或替代特征才能实现亚种水平的鉴别。

关键技术方法概述：花粉样品采自法国Vassal-Montpellier葡萄资源中心（INRAE, SupAgro）的26个葡萄个体，经KOH处理和醋解后制成固定玻片。使用自动化显微镜扫描获取图像，采用YOLOv5目标检测算法识别并分割花粉粒和石松孢子。为保留花粉尺寸信息，在图像四周添加黑色填充。使用预训练于ImageNet的ResNet152网络进行迁移学习，并采用随机翻转、亮度对比度变化等数据增强。设置两种实验设计：设计A（同个体参与训练和测试）和设计B（留出法，测试个体完全未见）。使用梯度加权类激活映射（Gradient-weighted Class Activation Mapping, Grad-CAM）可视化模型决策区域。采用线性混合效应模型分析花粉大小，用广义混合效应模型评估预测成功率与填充比例的关系。

研究结果：

3.1 基于CNN的野生和栽培葡萄三孔沟可育花粉图像分类。在实验设计A下，模型在“1-pollen/1-image”数据集上准确率为64.7±1.4%（均值±2SE），各性能指标均高于62.8%；在“1-pollen/4-images”数据集上，将每个花粉粒的四张图像预测向量求和得到“sum”结果，准确率为63.2±1.5%，“best”结果为63.0±1.4%，“all”结果为61.2±1.0%。模型未能实现高精度分类，且部分个体（如D4、W2）频繁被错分。在实验设计B下，两个数据集的准确率均降至约51%，与随机水平无异，且预测结果与真实亚种无关，说明模型主要依赖了个体特异性特征而非亚种共性特征。Grad-CAM热图显示，预测为“栽培”类时，模型激活常位于图像边缘的黑色填充区域（对应较小花粉），预测为“野生”类时，激活多位于花粉粒内部的萌发孔、沟和纹饰等结构。然而，激活模式并非系统性依赖于填充比例，说明模型还组合了其他形态特征。

3.2 葡萄亚种间三孔沟与无孔花粉的大小和产量。基于15,577个花粉边界框的面积估计，研究人员发现野生与栽培亚种间的花粉大小无显著差异（p=0.12），花粉形态型之间以及亚种与形态型的交互作用亦不显著。每花花粉产量在野生个体（平均约12,879粒）和栽培个体（平均约18,571粒）之间呈边缘性显著差异（p=0.07），但形态型间及其与亚种的交互作用不显著。这表明花粉大小不能作为区分野生与栽培葡萄的可靠形态学指标。

讨论与结论：该研究表明，CNN模型在个体已知时表现出的分类能力主要来源于个体或制片相关的特征，而非亚种间的固有差异。这可能是由于野生与栽培葡萄之间花粉形态高度相似，且驯化历史较短、存在基因渐渗，导致亚种间可能缺乏独特的可育花粉特征。个体间花粉极轴长、赤道径、P/E比及外壁纹饰等形态变异超过了亚种间差异。未来研究可采用扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscopy, SEM）和共聚焦扫描激光显微镜（Confocal Scanning Laser Microscopy, CSLM）等更高分辨率技术，或直接将花粉面积、极轴长等数值参数纳入模型输入，以提高鉴别能力。此外，研究还发现无孔不育形态型的花粉产量与可育形态型相当，提示该形态型在孢粉学分析中不应被忽视，可能有助于检测葡萄存在及判断植株类型。最终结论为：在光学显微镜图像条件下，使用标准分类CNN无法可靠区分野生和栽培葡萄的三孔沟可育花粉；花粉大小和形态特征的重叠是导致亚种判别失败的主要原因。该研究为孢粉学中人工智能应用提供了重要的否定性基线，并强调了发展更高分辨率成像或整合多维形态特征的必要性。