导向蛋白MsDIR6在紫花苜蓿中参与抗旱反应，并调控活性氧的清除和次生代谢物的生物合成

《Plant Science》：The dirigent protein MsDIR6 functions in drought tolerance and modulates reactive oxygen species scavenging and secondary metabolite biosynthesis in alfalfa

　　

**摘要**

紫花苜蓿（*Medicago sativa* L.）是一种在全球范围内具有重大意义的关键牧草作物，对保障全球粮食安全至关重要。然而，土壤水分亏缺会导致其产量大幅下降，对可持续牧草生产构成严重威胁。导向蛋白（DIR）在木质素生物合成和植物胁迫应答中发挥重要作用。本研究通过全基因组分析在紫花苜蓿中鉴定出52个MsDIR基因，并筛选出MsDIR6作为与抗旱性相关的关键候选基因。qRT-PCR结果显示，MsDIR6的转录在紫花苜蓿干旱胁迫下被显著诱导。MsDIR6在根和叶中优先表达，其蛋白定位于细胞核和质膜。在酵母中异源表达MsDIR6可提高对甘露醇诱导的渗透胁迫的耐性。在拟南芥中异源过表达MsDIR6可显著提高干旱胁迫下的种子发芽率、幼苗存活率和抗氧化能力，并通过调节气孔运动提高叶片持水能力。在转基因紫花苜蓿毛根中，MsDIR6缓解了干旱诱导的生长抑制，并增强了干旱胁迫下由抗氧化防御系统介导的活性氧（ROS）清除。转录组分析显示，MsDIR6激活了苯丙烷和类黄酮生物合成通路的关键基因，这对干旱适应中的ROS清除至关重要。此外，我们观察到MsDIR6过表达紫花苜蓿中类黄酮和木质素含量升高。总之，我们的发现为紫花苜蓿的抗旱机制提供了新的见解，并将MsDIR6鉴定为提高这一重要牧草作物的分子育种策略的有前景的遗传资源。

**引言**

干旱作为一种主要的非生物胁迫因子，通过扰乱水分吸收、降低光合效率和诱导氧化损伤，严重阻碍植物生长和作物产量（Zhang等，2022a）。有令人担忧的预测指出，干旱造成的产量损失将超过所有其他非生物和生物胁迫所造成损失之和，这对全球粮食安全构成了严重威胁（Yu等，2020）。应对不断加剧的全球干旱形势，植物已经演化出精密的分子机制，包括气孔关闭调控和活性氧（ROS）清除（Yang等，2022；Xiang等，2025a）。这些机制对于在水分亏缺条件下维持产量至关重要，通过赋予植物适应干旱胁迫的能力实现适应性韧性。ROS是植物有氧代谢的必然副产物，其积累会引起严重的细胞氧化损伤（Mittler，2002）。细胞对ROS的防御包括过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）等抗氧化酶，以及还原型谷胱甘肽、类黄酮和木质素等非酶类抗氧化剂（Sakakibara等，2003；Mittler等，2004）。此外，ROS的清除还依赖于植物的一系列代谢过程和基因表达（Wang等，2024a）。

木质素是一类天然酚类化合物，对植物防御反应有贡献（Chhillar等，2021）。其生物合成通路以前体分子松柏醇为起点（Davin等，1997）。该通路中的一个关键调控步骤由导向蛋白（DIR）家族介导，它引导松柏醇的对映选择性偶联，形成关键中间体松脂醇。随后，松脂醇经过进一步的酶促修饰和结构转变，产生多种木质素结构（Gasper等，2016）。因此，DIR蛋白在整个木质素生物合成通路中发挥关键的调控作用。第一个DIR蛋白于1997年在连翘（*Forsythia suspensa*）中被发现，其特征为二聚体构型（Davin等，1997）。DIR家族基于保守基序和功能分化被分为七个亚家族（DIR-a至DIR-g）（Paniagua等，2017）。DIR-a亚家族的一个关键功能是催化松脂醇的合成，例如拟南芥（*Arabidopsis thaliana*）中的AtDIR5和AtDIR6产生(-)-松脂醇（Kim等，2012），以及细叶水蔓菁（*Phryma leptostachya*）中的PlDIR1产生(+)-松脂醇（Kim等，2012；Pei等，2023）。此外，其他不形成松脂醇的DIR和DIR样蛋白也在植物生长中发挥作用（Ralph等，2007）。例如，番茄（*Solanum lycopersicum*）DIR-f亚家族中的SRF蛋白在催化18-oxo-CLA的立体选择性环化以形成单子叶植物特有的萌发刺激物方面发挥关键作用（Ueno等，2011；Homma等，2024）。随着全基因组数据的发表，DIR基因家族已在多个物种中被鉴定，包括芸薹属植物中29个（Thamil Arasan等，2013）、马蓝（*Isatis indigotica*）中19个（Li等，2014）、亚麻（*Linum usitatissimum*）中44个（Corbin等，2018）、三七（*Panax notoginseng*）中7个（Deng等，2022）以及大豆（*Glycine max*）中26个（Ma等，2021）。

DIR蛋白的主要生理作用是介导植物对非生物胁迫的防御，特别是在心材和种子形成组织中（Davin等，1997；Xia等，2000；Ralph等，2006）。例如，在辣椒中沉默CaDIR7基因会损害细胞膜稳定性和光合功能，从而降低植物对盐胁迫的耐受性（Khan等，2018）。DIR介导的木质素生物合成在转录水平上受到调控以赋予非生物胁迫耐受性。在菖蒲（*Acorus tatarinowii*）中，AtsDIR23受到AtsMYB91的负调控，从而调节木质素的合成（Guo等，2023）。在马蓝中，ERF转录因子LTF1直接激活DIR1转录，促进木质素积累以实现氧化保护和增强盐胁迫抗性（Chen等，2024a）。除木质素代谢外，玉米中与DIR相关的ZmSTL1基因可加固内皮层凯氏带以阻断质外体Na?内流，从而提高盐耐性（Wang等，2022）。总之，这些发现表明DIR基因家族及其调节因子使植物能够部署一系列既保守又物种特异性的策略，以有效适应非生物胁迫。

苯丙烷生物合成通路是植物胁迫应答的核心，其众多受调控的基因和代谢物与抗旱性密切相关（Shim等，2025）。该通路始于苯丙氨酸，由苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸4-羟基化酶（C4H）和4-香豆酰-CoA连接酶（4CL）将其转化为对香豆酰-CoA。这一关键前体随后启动多个下游分支通路，调控超过8000种次生代谢物的产生（Dong和Lin，2021）。该通路的一个关键产物木质素，对水分和养分运输是必需的，可显著提高植物抗旱性（Zhao，2016）。另一个主要分支是类黄酮生物合成通路，参与植物发育和防御等次生代谢过程（Buer等，2010）。类黄酮具有强效的抗氧化特性，可调节ROS水平，在植物抗旱性中发挥关键作用（Taylor和Grotewold，2005）。这一功能已在拟南芥、大豆和水稻中得到实证验证（Nakabayashi等，2014；Wang等，2024b；Xiang等，2025b）。因此，苯丙烷和类黄酮生物合成通路构成了支撑植物适应干旱胁迫的关键调控网络。

紫花苜蓿是一种多年生豆科牧草，以高蛋白含量和营养价值被誉为"牧草之王"，因其高产量和优质的饲料品质而在全世界广泛栽培（Gou等，2018；Wolabu等，2023）。然而，干旱是其生长和产量面临的重大限制因素（Yang等，2025；Zhao等，2025）。因此，鉴定和利用紫花苜蓿中的抗旱遗传资源，对于通过分子育种开发具有更强韧性的新品种、提高其产量和可持续性至关重要。

在本研究中，我们对紫花苜蓿DIR基因家族进行了全面的全基因组分析，结合生物信息学和表达谱分析，鉴定MsDIR6作为潜在的抗旱基因。我们通过拟南芥GUS染色验证了MsDIR6的组织特异性表达，并证实其蛋白同时定位于细胞核和质膜。利用转基因酵母、拟南芥和紫花苜蓿毛根的功能实验表明，MsDIR6过表达与抗氧化酶活性增强和气孔运动改变相关，伴随着干旱胁迫下ROS清除的加强和蒸腾的降低。转录组数据进一步揭示，MsDIR6激活了苯丙烷和类黄酮生物合成相关基因，这可能促进ROS消除和干旱适应。这些发现为通过分子育种改善紫花苜蓿及相关牧草作物胁迫耐受性提供了有价值的遗传靶标。

**章节片段**

**紫花苜蓿基因组中DIR基因的鉴定**

利用紫花苜蓿基因组数据（Shen等，2020），我们最初通过TBtools软件（Chen等，2020）进行比对分析，初步鉴定出候选DIR基因家族成员。通过Pfam（http://pfam.xfam.org/）和InterPro（https://www.ebi.ac.uk/interpro/）数据库搜索确认候选基因中保守的DIR结构域（PF03018）的存在，最终鉴定出MsDIR基因家族。MsDIR蛋白的理化性质，包括氨基酸……

**MsDIR基因家族成员的基本信息**

基于Pfam、InterPro和NCBI CD Search数据库的保守导向结构域（PF03018）的存在，并以严格的阈值（E-value < 1e-5）进行筛选，在紫花苜蓿基因组中鉴定出52个DIR家族成员（支持表格：表S2）。编码的MsDIR蛋白在理化性质上差异显著。它们的长度范围为48至467个氨基酸（aa），对应的分子量（MW）为5.64至52.46 kDa。预测的等电点（pI）……

**讨论**

植物的抗旱性由一个复杂的调控网络控制，该网络整合了多层次生理和生化过程以及动态的遗传相互作用（Ansari等，2022）。该网络的一个关键组成部分是一个精密的抗氧化系统，已演化出减轻干旱胁迫下过量ROS造成的蛋白质、脂质和其他生物大分子氧化损伤的能力（Huang等，2016）。虽然DIR家族基因已知参与植物非生物胁迫……

**结论**

总之，本研究提供了相关性证据，表明MsDIR6过表达通过综合的生理和代谢调节与紫花苜蓿抗旱性的提高相关联。这些调节包括ROS解毒的增强、苯丙烷和类黄酮生物合成的激活并伴随木质素和类黄酮的积累，以及气孔的改变以减少蒸腾水分损失。这些反应的汇合与缓解干旱诱导的……

**知情同意声明**

作者声明不存在利益冲突。

**作者贡献**

所有作者均对本研究有所贡献。

**数据可用性**

支持本文研究结果的所有数据均包含在论文中及其补充信息文件中。用于RNA-seq分析的原始数据已提交至中国国家基因数据科学数据中心（登录号：PRJNA1377414）。

**补充信息**

额外的补充信息可在线支持信息部分找到。

**资助**

本工作得到宁夏回族自治区重点研发计划（2023BSB03065）和国家自然科学基金委（U24A20426）的资助。

**CRediT作者贡献声明**

S L和Y M规划和设计了研究。Y M、X W和D Y完成了生物信息学分析。Y M进行了实验验证。Y M、R Y和S L撰写了稿件。所有作者讨论并修改了稿件。

**CRediT作者贡献声明**

Rongchen Yang：撰写——审阅与编辑。Yonglong Ma：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、资源、方法学、调查研究、形式分析、数据整理、概念构思。Shuxia Li：撰写——审阅与编辑、指导、软件、项目管理、调查研究、经费获取。Dongwen Yu：概念构思。Xiaotong Wang：形式分析。

**利益冲突声明**

作者声明，他们没有已知的可能影响本文所报告工作的相互竞争的财务利益或个人关系。

Yonglong Ma | Rongchen Yang | Xiaotong Wang | Dongwen Yu | Shuxia Li
宁夏大学林草学院，宁夏，银川，中国