# 禽致病性大肠杆菌分泌的外膜囊泡通过MSTRG.11745.1/gga-miR-15b-5p/TNFAIP3轴调控线粒体自噬促进巨噬细胞内存活与全身感染

《Poultry Science》：Outer membrane vesicles secreted by avian pathogenic Escherichia coli promote intracellular survival in macrophages and systemic infection by regulating mitophagy through the MSTRG.11745.1/gga-miR-15b-5p/ TNFAIP3 axis

　　

禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic *Escherichia coli*, APEC）是一种重要的肠道外病原菌，可引起家禽局部和全身性感染，对全球养禽业造成重大经济损失。APEC通过劫持巨噬细胞作为其胞内生存的主要场所来逃避宿主免疫系统并建立持续性感染。在该病理过程中，APEC分泌的外膜囊泡（outer membrane vesicles, OMVs）作为向宿主细胞递送毒力因子的关键载体发挥重要作用。然而，OMVs破坏巨噬细胞防御机制并促进APEC胞内存活的特定机制尚未完全阐明。研究人员证明，APEC OMVs破坏鸡巨噬细胞（HD11）的线粒体结构并导致线粒体膜电位崩溃。这种损伤诱导的线粒体自噬导致应激相关活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平降低，从而促进APEC的胞内存活和全身感染。此外，使用线粒体自噬抑制剂干预可显著降低线粒体自噬导致的胞内存活程度（P < 0.01）以及雏鸡组织中的细菌载量（气管：P < 0.001；肺：P < 0.001；肝：P < 0.001；脾：P < 0.01）。进一步，研究人员通过转录组学筛选鉴定了一个与线粒体自噬相关的新型长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）——MSTRG.11745.1，上调的MSTRG.11745.1作为竞争性内源RNA（competitive endogenous RNA, ceRNA），结合gga-miR-15b-5p以调控TNFAIP3表达，从而促进线粒体自噬和APEC的胞内存活。总之，APEC来源的OMVs诱导宿主巨噬细胞发生严重的线粒体损伤，同时激活MSTRG.11745.1/gga-miR-15b-5p/TNFAIP3 ceRNA轴并促进线粒体自噬，这一过程有助于APEC的免疫逃逸和全身感染。该研究为OMVs如何使APEC逃逸巨噬细胞固有免疫监视的核心机制提供了新的见解。

# 禽致病性大肠杆菌外膜囊泡通过lncRNA-miRNA-mRNA调控轴介导线粒体自噬促进胞内存活与系统性感染的机制解读

## 1. 研究背景与科学问题

禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic *Escherichia coli*, APEC）作为一种肠道外致病性大肠杆菌（extraintestinal pathogenic *E. coli*, ExPEC），主要经呼吸道和消化道传播，可引起家禽局部及全身性感染，给全球养禽业造成显著经济损失。由于APEC与人源ExPEC具有遗传相似性，其还具备相当的人畜共患潜势。在宿主-病原体互作过程中，巨噬细胞既是抵御APEC感染的第一道防线，同时也为APEC在宿主内的存活提供了重要的胞内生态位。APEC通过多种策略逃避免疫杀伤，例如利用UhpAB系统增强应激耐受性，以及利用PhoP/PhoQ-HlyF系统抑制吞噬溶酶体酸化并破坏其膜结构，从而增强在巨噬细胞内的存活与复制能力。

病原菌在宿主定植与感染过程中分泌外膜囊泡（outer membrane vesicles, OMVs），这些球形脂质双分子层纳米颗粒携带多种毒力因子，兼具触发宿主免疫应答和促进病原体致病性的双重作用。一方面，OMVs携带的大量免疫刺激分子可被宿主模式识别受体识别并激活炎症反应；另一方面，致病菌也积极利用OMVs向宿主细胞递送效应分子，以破坏细胞功能并介导免疫逃逸。既往研究表明，淋病奈瑟菌（*Neisseria gonorrhoeae*）、尿道致病性大肠杆菌和铜绿假单胞菌（*Pseudomonas aeruginosa*）分泌的OMVs均可导致线粒体功能障碍，进而抑制宿主蛋白合成并诱导线粒体凋亡。然而，APEC来源的OMVs如何调控宿主免疫并逃避免疫清除，其促进全身性感染的作用机制仍有待深入研究。

线粒体作为宿主细胞内的关键细胞器，在病原感染过程中常成为攻击靶点。宿主细胞可通过线粒体自噬（mitophagy）途径清除受损线粒体以恢复稳态，但这一防御机制常被病原体利用。铜绿假单胞菌、牛分枝杆菌（*Mycobacterium bovis*）、金黄色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus*）和鼠伤寒沙门氏菌（*Salmonella typhimurium*）等均可通过诱导线粒体自噬来抑制ROS产生和炎症小体活化，从而促进胞内存活。长链非编码RNA（lncRNA）和微小RNA（miRNA）已被证实可通过形成竞争性内源RNA（competing endogenous RNA, ceRNA）调控网络参与宿主抗感染免疫、细胞自噬和线粒体质量调控。肿瘤坏死因子-α诱导蛋白3（tumour necrosis factor-α-induced protein 3, TNFAIP3）作为一种关键的泛素编辑蛋白，在调控线粒体自噬和细胞器稳态中的作用日益受到关注。

基于上述背景，本研究提出了核心科学问题：APEC来源的OMVs是否通过诱导线粒体自噬来促进其胞内存活与全身感染？其中是否涉及lncRNA-miRNA-mRNA调控轴的介导？该研究旨在阐明APEC OMVs介导免疫逃逸的分子机制，为APEC防控新策略的开发提供理论基础。

## 2. 研究概述与主要结论

研究人员采用体内外相结合的感染模型，系统研究了APEC OMVs诱导HD11细胞线粒体自噬的分子机制。研究发现，APEC OMVs可被HD11细胞内化并靶向线粒体，破坏线粒体结构，导致线粒体膜电位（ΔΨm）崩溃和线粒体碎片化。OMVs通过诱导损伤相关线粒体自噬降低应激性ROS水平，从而促进APEC胞内存活与全身感染。通过转录组测序和生物信息学预测，研究人员鉴定了一个新型lncRNA MSTRG.11745.1，该lncRNA在APEC OMVs刺激下显著上调，作为ceRNA海绵吸附gga-miR-15b-5p，解除其对靶基因TNFAIP3的抑制作用，从而促进线粒体自噬和APEC胞内存活。该研究首次鉴定了参与APEC OMVs诱导线粒体自噬的lncRNA-miRNA-mRNA调控轴，为理解APEC致病机制提供了新视角，也为APEC防治策略的开发奠定了理论基础。

## 3. 主要关键技术与方法

本研究使用了以下关键技术方法：（1）OMVs提取与纯化：采用超滤浓缩结合OptiPrep密度梯度离心法从APEC81培养上清中提取纯化OMVs，通过纳米颗粒跟踪分析、透射电子显微镜和Western blotting进行表征；（2）庆大霉素保护实验：用于评估APEC在HD11细胞内的存活能力；（3）透射电子显微镜观察：用于分析OMVs形态以及线粒体超微结构损伤和自噬体包裹线粒体的现象；（4）激光共聚焦显微镜和免疫荧光染色：用于评估OMVs与线粒体共定位、线粒体-自噬体/溶酶体共定位以及ROS水平和线粒体膜电位变化；（5）Western blotting和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）：用于检测线粒体蛋白（TOM20、TIMM23）降解、LC3-II转化及mtDNA拷贝数变化；（6）转录组测序及生物信息学分析：进行差异表达lncRNA鉴定、ceRNA网络构建以及GO/KEGG富集分析；（7）双荧光素酶报告基因实验：验证MSTRG.11745.1与gga-miR-15b-5p及gga-miR-15b-5p与TNFAIP3之间的直接结合关系；（8）雏鸡体内感染模型：通过气管接种建立全身感染模型，评估组织病理损伤和细菌载量。样本来源包括临床分离株APEC81（血清型O166:H45，分离自安徽地区死于大肠杆菌败血症的鸡肺脏）及其OMVs分泌缺陷株APEC81ΔypjA和APEC81ΔldcA突变株；细胞模型使用鸡巨噬细胞系HD11和人胚胎肾细胞293T细胞。

## 4. 主要研究结果

### 4.1 APEC通过分泌OMVs增强感染并诱导自噬

研究人员首先分离纯化了APEC OMVs并进行了表征。透射电镜显示OMVs呈典型球形双层膜结构，粒径主要分布在20–400 nm。DiO标记的OMVs可被HD11细胞高效内化。与野生型（WT）相比，OMVs分泌缺陷株ΔypjA在感染后1、2、3小时的胞内存活率均显著降低。在雏鸡感染模型中，WT感染组表现出更严重的组织病理损伤。此外，研究人员发现APEC OMVs可明显诱导LC3斑点聚集，且ΔldcA来源的OMVs虽降低了自噬水平但仍显著高于对照组，说明APEC OMVs除通过NOD1依赖性途径激活自噬外，还存在其他替代机制。

### 4.2 APEC通过分泌OMVs诱导HD11细胞线粒体碎片化

激光共聚焦显微镜观察到DiO标记的OMVs与Mito-Tracker存在明显共定位，提示OMVs与线粒体相关并发挥效应。透射电镜显示OMVs处理组细胞线粒体出现明显的嵴断裂、肿胀和膜破裂。Mito-Tracker染色结果显示，OMVs处理后线粒体由高度互联的管状网络结构变为碎片化的分散点状或短棒状结构。JC-1染色检测发现，WT感染或OMVs处理均可引起ΔΨm随时间依赖性下降，且OMVs分泌缺陷显著减弱了膜电位的下降程度。

### 4.3 APEC通过分泌OMVs诱导HD11细胞线粒体自噬

透射电镜观察到OMVs处理组细胞中受损线粒体被自噬结构包裹并与溶酶体结构相关联。免疫荧光结果显示，APEC OMVs促进了线粒体与LC3及LAMP1的共定位，而线粒体自噬抑制剂Mdivi-1可显著降低这种共定位。Western blotting结果显示，APEC OMVs处理增强了LC3-I向LC3-II的转化并促进了线粒体膜蛋白TIMM23和TOM20的降解。qPCR检测显示APEC感染或OMVs处理均显著降低了mtDNA水平。Mdivi-1处理可有效逆转OMVs诱导的线粒体蛋白降解。

### 4.4 APEC通过分泌OMVs诱导线粒体自噬促进全身性感染

APEC OMVs处理HD11细胞后，ROS水平在3小时显著升高，随后在6小时后逐渐降低。Mdivi-1干预显著减缓了ROS水平的下降。Mdivi-1预处理可显著降低APEC的胞内存活率，而CCCP（线粒体自噬诱导剂）和Mito-TEMPO（ROS清除剂）则增强了胞内存活。在雏鸡体内模型中，与单独WT感染组相比，Mdivi-1处理显著减轻了气管、肺、肝和脾的组织病理损伤，并显著降低了各组织的细菌载量（气管、肺、肝：P < 0.001；脾：P < 0.01）。

### 4.5 APEC OMVs通过MSTRG.11745.1调控线粒体自噬

转录组测序和ceRNA网络分析鉴定出一个新型lncRNA MSTRG.11745.1，APEC OMVs处理可显著上调其表达水平。靶基因预测和共表达分析显示其潜在靶基因富集于线粒体自噬相关通路。敲低MSTRG.11745.1显著降低了OMVs诱导的线粒体与LC3及LAMP1的共定位，且显著降低了APEC的胞内存活率。值得注意的是，敲低MSTRG.11745.1后，WT与ΔypjA之间的胞内存活差异被消除。

### 4.6 MSTRG.11745.1正向调控TNFAIP3诱导的线粒体自噬

APEC OMVs处理6小时后TNFAIP3表达显著上调。干扰TNFAIP3显著降低了线粒体与LC3及LAMP1的共定位。过表达MSTRG.11745.1可显著上调TNFAIP3的表达。拯救实验表明，TNFAIP3敲低可显著逆转MSTRG.11745.1过表达所致的线粒体-自噬体/溶酶体共定位增强效应，证实TNFAIP3是MSTRG.11745.1调控线粒体自噬的关键下游靶基因。

### 4.7 MSTRG.11745.1通过gga-miR-15b-5p/TNFAIP3轴调控线粒体自噬

生物信息学预测发现MSTRG.11745.1与gga-miR-15b-5p存在潜在结合位点，双荧光素酶报告实验证实了两者的直接结合。过表达gga-miR-15b-5p显著减弱了线粒体与LC3及LAMP1的共定位信号。此外，gga-miR-15b-5p被证实可直接结合TNFAIP3的3'UTR区域。过表达MSTRG.11745.1可显著逆转gga-miR-15b-5p对TNFAIP3报告基因荧光强度的抑制作用，表明MSTRG.11745.1通过吸附gga-miR-15b-5p来解除其对TNFAIP3的抑制效应。

## 5. 综合讨论与研究结论

### 5.1 讨论总结

APEC的持续性感染高度依赖于其逃避免疫清除和胞内存活的能力。本研究发现OMVs分泌缺陷株的胞内存活能力和组织病理损伤程度均显著低于野生型菌株，证实APEC OMVs通过增强体内定植和胞内存活来诱导持续性全身感染。NOD1信号通路可能参与APEC OMVs诱导的自噬，但不是唯一调控机制。

在线粒体损伤方面，APEC OMVs被HD11细胞内化后靶向线粒体，破坏线粒体网络结构，导致ΔΨm下降和ROS水平短暂升高。OMVs分泌缺陷显著减弱了对线粒体膜电位的损伤，表明APEC依赖OMVs破坏线粒体功能以削弱宿主细胞的杀菌能力。

在线粒体自噬调控方面，本研究提供了APEC通过分泌OMVs诱导HD11细胞线粒体自噬的直接证据。APEC通过OMVs介导的线粒体自噬清除受损线粒体，降低胞内ROS积累，从而促进其在巨噬细胞内的存活。线粒体自噬抑制可显著降低APEC在HD11细胞内的存活率，降低雏鸡感染模型中各组织的细菌载量并减轻病理损伤。这表明靶向抑制线粒体自噬可能是抑制APEC持续性感染的有效策略。

在非编码RNA调控方面，本研究突破传统蛋白水平信号级联研究的局限，鉴定了一个在APEC OMVs处理后显著上调的新型lncRNA MSTRG.11745.1。研究人员证实MSTRG.11745.1作为ceRNA，通过海绵吸附gga-miR-15b-5p调控TNFAIP3表达，从而促进线粒体自噬。这种转录后调控策略可能重塑宿主免疫微环境，有助于胞内病原菌的持续性感染。

TNFAIP3除经典的抗炎功能外，还被证实参与自噬和线粒体质量控制。本研究发现TNFAIP3正向调控APEC OMVs诱导的线粒体自噬，推测其可能通过泛素编辑活性促进受损线粒体的清除。

### 5.2 结论

APEC来源的OMVs靶向HD11细胞的线粒体并导致线粒体损伤。这种损伤通过MSTRG.11745.1/gga-miR-15b-5p/TNFAIP3轴诱导线粒体自噬。线粒体自噬降低了细胞内ROS水平，促进了APEC在HD11细胞中的存活，并可能促进全身性感染。该研究为OMVs介导APEC免疫逃逸的作用提供了新视角，为进一步探索APEC疾病的免疫调节策略奠定了理论基础。