《HemaSphere》：Clonotypic characterization defines B-cell drivers of clonal expansion and intratumor heterogeneity in IgM monoclonal gammopathies
编辑推荐：
Waldenstr?m巨球蛋白血症（WM）与意义未明的IgM单克隆丙种球蛋白病（IgM MGUS）具有相同的起源细胞，但克隆大小不同。与其他B细胞肿瘤相比，WM中的淋巴浆细胞克隆可能相当小，限制了研究人员对克隆扩增机制的理解。研究人员采用整合策略，结合单细胞R
Waldenstr?m巨球蛋白血症（WM）与意义未明的IgM单克隆丙种球蛋白病（IgM MGUS）具有相同的起源细胞，但克隆大小不同。与其他B细胞肿瘤相比，WM中的淋巴浆细胞克隆可能相当小，限制了研究人员对克隆扩增机制的理解。研究人员采用整合策略，结合单细胞RNA与B细胞受体（BCR）测序、转座酶可及染色质分析（assay for transposase-accessible chromatin, ATAC）及全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS），对IgM MGUS、冒烟型WM（smoldering WM, SWM）和有症状WM（WM）患者的肿瘤克隆进行了表征。与WM相比，IgM MGUS和低危或中危SWM携带多个B细胞克隆。CD9、JCHAIN、RASSF6和DUSP22在基因表达和染色质活性水平上是优势B细胞克隆的主要标志物，其中CD9优先在浆细胞样（plasma cell-like, PC-like）肿瘤细胞中表达。POU2F2在肿瘤克隆中具有高活性，并与CD9调控区相关联。MYD88和IGLL5突变主要与突变特征SBS5相关，存在于次要克隆中，而MYD88突变也见于未扩增的B细胞中。高危患者的肿瘤细胞中存在6q缺失，该变异赋予细胞相对于拷贝中性肿瘤细胞的适应性优势。编码突变将寡克隆患者的肿瘤克隆和次要克隆聚集在一起，并与异常转录程序相关。B细胞克隆还显示出与单核细胞富集的预测相互作用。该整合单细胞方法揭示了克隆大小在IgM丙种球蛋白病中的重要性，并确定了促进克隆扩增的关键标志物。
**一、研究背景与科学问题**
Waldenstr?m巨球蛋白血症（WM）是一种产生单克隆IgM的淋巴浆细胞淋巴瘤，其临床病程高度异质性，部分患者可长期处于无症状期。意义未明的IgM单克隆丙种球蛋白病（IgM MGUS）作为WM的癌前状态，其淋巴浆细胞克隆可通过多参数流式细胞术和二代测序检出，提示克隆扩增可早于显性淋巴瘤数年启动。恶性克隆起源于生发中心（GC）内携带MYD88 L265P反复突变的自我增殖记忆B细胞。然而，动物模型提示该突变本身不足以驱动克隆扩增，且临床多中心研究未能将MYD88突变纳入无进展生存或总生存模型。CXCR4、ARID1A、CD79B突变及6q缺失（del6q）被提出为WM疾病进展的驱动基因组改变，但由于其亚克隆等位基因频率低，基于bulk测序技术难以准确评估。在单细胞水平，WM恶性克隆呈现浆细胞样（PC-like）或记忆B细胞样（MBC-like）表型，但低肿瘤负荷病例中骨髓（BM）浸润变异大、克隆组成复杂，肿瘤特异性生物标志物的评估面临挑战。基于此，研究人员开展本研究，旨在通过整合单细胞多组学策略，系统表征IgM MGUS、SWM和WM中B细胞克隆的组成、驱动克隆扩增的关键分子事件及其与临床结局的关系。
**二、研究内容与主要结论**
研究人员对12例患者（3例IgM MGUS、4例SWM、5例WM）的16份BM和/或外周血（PB）样本进行了整合分析。通过单细胞5′RNA联合BCR测序、单细胞ATAC测序和WGS，结合克隆型鉴定、转录因子（TF）基序活性分析、体细胞突变与拷贝数变异（CNA）推断及细胞间通讯分析，揭示了IgM丙种球蛋白病中克隆结构、基因组特征和肿瘤微环境（TME）之间的复杂关系。研究发现，IgM MGUS和低危SWM呈寡克隆格局，而高危/有症状WM以单一优势克隆为主；优势克隆高表达CD9、JCHAIN、RASSF6、DUSP22等标志物，且POU2F2 TF活性与CD9调控区相关联；MYD88和IGLL5突变（SBS5特征）见于次要克隆甚至未扩增B细胞；del6q在高危患者肿瘤细胞中赋予适应性优势，并伴随代谢重编程；克隆特异性突变与异常转录程序相关，且优势克隆与单核细胞存在富集的配体-受体相互作用。该研究揭示了克隆大小在IgM丙种球蛋白病中的核心作用，鉴定出促进克隆扩增的关键标志物，为理解WM从寡克隆前体状态向优势克隆演进的机制提供了整合框架。论文发表在《HemaSphere》。
**三、关键技术方法**
研究人员采用了以下主要技术方法：（1）单细胞5′RNA与BCR测序（10× Genomics Chromium平台）表征134,040个细胞的转录组和B细胞受体克隆型；（2）单细胞ATAC测序（sc-ATAC）分析4份BM样本的染色质可及性及TF基序活性；（3）WGS对14份肿瘤/正常样本（含2对BM-PB配对和2对纵向配对样本）检测SNV、CNA和结构变异，并进行突变特征拟合；（4）整合分析使用Seurat、Signac、ChromVAR、InferCNV、SComatic和LIANA等工具。样本来自巴塞罗那医院诊所生物样本库，涵盖IgM MGUS、SWM和WM各临床阶段。
**四、研究结果**
**1. BCR克隆型表征鉴定肿瘤克隆及其他寡克隆B细胞**
通过sc-RNA测序和BCR分析，研究人员在61,176个B细胞和浆细胞中鉴定出优势克隆C1（N=57,313）及多个次要克隆（C2–C5、其他扩增克隆）和未扩增细胞。C1克隆在SWM和WM中显著大于IgM MGUS（P=0.036），低危SWM呈现类似IgM MGUS的寡克隆格局。记忆B细胞构成各克隆的主体（>83%），PC样细胞在C1中比例低于12%。PCA分析显示C1细胞在多数样本中与其他克隆分离，而次要克隆与未扩增细胞共定位。伪bulk差异表达分析（DGE）显示，C1细胞上调CD9、JCHAIN、IGHM、DUSP22和RASSF6，次要克隆上调IGHG2、ADAM28等，未扩增细胞高表达BCL7A、SOX4等。基于已发表特征基因评分，CD9仅在PC样C1细胞中优先上调，呈现状态依赖性表达模式。C1细胞还富集Toll样受体、NF-κB、IL6-JAK/STAT3和MAPK信号通路。此外，所有B细胞均表达MS4A1（CD20），TNFRSF13C（BAFFR）是C1细胞中仅次于CD20的高表达标记，而TNFRSF17（BCMA）表达低或缺失。
**2. B细胞克隆呈现不同的染色质可及性模式**
整合sc-RNA和sc-ATAC数据（30,033个B细胞）后，差异基序可及性分析显示，C1细胞中OCT/POU家族、FOXP1和NFKB2基序活性增高，而XBP1、KLF3/9、IRF4和SMAD家族基序在次要克隆中富集，PRDM1、SPIB和PAX5在未扩增细胞中富集。POU家族是C1细胞与未扩增细胞比较中最显著的差异TF。差异可及性分析显示，C1细胞在CD9、DUSP22、RASSF6和JCHAIN基因座的染色质可及性增高，其中CD9顺式调控元件位于chr12:6.44 Mb区域，含有POU2F1/2基序并邻近CD27位点。
**3. POU转录因子在肿瘤克隆中的活性**
POU2F1/2在C1细胞中与浆母细胞程序（IRF4、XBP1、PRDM1）解偶联，与SPIB呈负相关（r=?0.49）；次要克隆呈可塑状态，POU2F1/2与NFKB2相关；未扩增细胞呈现更生理性的GC向浆母细胞过渡模式。基于诊断分组，POU2F2在WM中高度活跃，而IgM MGUS和SWM中IRF4、XBP1和PRDM1活性更高。峰-基因关联分析将POU2F1/2基序与CD9调控区连接，且CD9活性与POU2F1（r=0.23, P<0.001）和POU2F2（r=0.21, P<0.001）基序活性正相关，提示POU2F2参与CD9转录激活。足迹分析证实SWM患者C1细胞中POU2F2占据CD9调控区。
**4. IgM MGUS和WM的基因组图谱**
WGS分析显示所有样本均携带MYD88 L265P突变，≥3例患者存在IGLL5和PRDM1编码突变，2例患者存在CXCR4小插入缺失。del6q和6p增益（gain6p）见于4例患者，涉及TNFAIP3、PRDM1、IBTK、FOXO3、ARID1B等基因。额外CNA影响MYC（chr8）和BCL2（chr18）。1例R/R WM和1例高危SWM存在涉及chr7、chr8、chr6和chr2的易位。1例5年后进展的中危IgM MGUS携带chr11和chr19缺失及chr18增益，另1例携带累及TP53的chr17缺失。突变特征分析显示SBS1、SBS5、SBS8和SBS9为主要特征，反映衰老相关突变过程及AID/poly-η活性。
**5. B细胞克隆的整合基因组表征**
通过整合sc-RNA和WGS数据鉴定出114个编码突变，C1细胞携带大多数体细胞突变，MYD88 L265P存在于所有样本。MYD88突变也见于1例IgM MGUS和1例SWM的次要克隆及该SWM患者的未扩增B细胞。IGLL5突变在另外2例的次要克隆中检出。TP53突变仅见于2例患者的C1细胞。SBS5是MYD88和IGLL5突变的主要特征，提示它们与衰老相关突变过程有关。在Pnt9中，CD83突变细胞与H1-4突变细胞分离，而多数C1细胞携带del6q；Pnt3中整个chr18增益集中在C1细胞；Pnt13中IGLL5突变优先见于C1细胞。
**6. 瘤内异质性伴随基因组改变和异常基因表达程序**
对Pnt10和Pnt12（均有BM和PB配对样本）的分析显示，WGS推断的亚克隆在单细胞水平呈空间聚集。Pnt10中del6q或del17p细胞共定位并形成C1亚簇；Pnt12中RPS20和PLEKHJ1突变细胞在BM和PB中均与其他C1细胞分离，而gain18q存在于所有C1细胞。基于RPS20和PLEKHJ1突变状态的DGE分析显示，CD9阳性细胞与VPREB3（未成熟B细胞标志）阳性细胞分离，提示突变定义的亚克隆具有不同转录程序。
**7. 6q缺失对疾病进展或转化的影响**
纵向分析中，Pnt2（高危SWM，1年后需治疗）在两个时间点均存在MYD88、IGLL5、H1-4突变及del6q/gain6p，其中TMED4突变与del6q C1细胞簇共定位且CD9表达降低。Pnt5（R/R WM，2年后转化为DLBCL）中，del6q C1细胞在转化时扩增，CD9低表达细胞与gain8p/SRRT突变细胞分离。比较del6q C1细胞（4,309个）与拷贝中性C1细胞（7,144个）的DGE分析显示，TNFAIP3、BACH2、FOXO1、CCL4和LYN下调，JCHAIN、RASSF6、IGHM、PIM2、RGS1和HCK上调；GSEA分析显示del6q细胞富集OXPHOS和代谢相关通路。
**8. 免疫细胞与B细胞克隆的通讯**
细胞间通讯分析（含21,860个CD4 T细胞、14,935个CD8 T细胞、4,075个NK细胞和5,056个单核细胞）显示，C1细胞与单核细胞的相互作用频率最高，其次是CD8 T细胞。以免疫细胞为来源，C1细胞富集CXCL8-CD79A、S100A8-CD69、S100A9-CD68、VCAN-CD44/ITGA4/SELL、TNFSF13B/TNFSF13-TNFRSF13B和PTGS2-ALOX5相互作用。以B细胞为来源，C1细胞富集SERPINF1-PLXDC2、CCN2-LRP1和ANGPTL1-LILRB2相互作用。BAFF/APRIL与TACI的相互作用在C1细胞中显著富集，提示单核细胞来源的信号可能支持克隆扩增。
**五、讨论与结论**
研究首次在低肿瘤负荷IgM丙种球蛋白病中系统整合BCR克隆型、转录组、染色质可及性和基因组数据，揭示了从寡克隆前体状态向优势克隆演进的动态过程。研究人员确认记忆B细胞是各克隆的主要成分，但仅有少量浆细胞与记忆B细胞共享BCR序列，支持记忆B细胞克隆扩增后部分向浆细胞分化的模型。CD9表达的异质性及其与POU2F2调控区的关联提示其作为状态依赖性标志物而非通用肿瘤标志物；BAFFR和TACI相对于BCMA的较高表达及单核细胞来源BAFF/APRIL的富集相互作用，为BAFFR靶向治疗提供了依据。del6q在高危患者中与代谢重编程和适应优势相关，可能是晚期事件。MYD88突变在未扩增B细胞中的检出支持其作为年龄相关淋巴样克隆造血事件的假说。研究局限性包括样本量有限、单细胞测序深度不足、CXCR4小插入缺失无法纳入整合分析及纵向病例数少。总体而言，该研究提出WM可能起源于携带MYD88 L265P等早期突变的寡克隆B细胞景观，后续克隆优势化与基因组、转录、表观遗传和微环境特征共同作用，最终驱动疾病进展。
