整合单细胞和多组学分析解析鸡卵泡选择过程中的颗粒细胞程序

《Poultry Science》：Integrative single-cell and multi-omic analysis resolves granulosa-cell programs during chicken follicle selection

　　

卵泡选择维持着产蛋母鸡的分层排卵周期，然而颗粒细胞（granulosa-cell，GC）程序尚未在转录组、调控和性状遗传数据集之间进行整合。研究人员将GC单细胞RNA测序与独立的bulk转录组、ATAC-seq、Hi-C以及ChickenGTEx GWAS/eQTL资源进行了整合。对62,997个细胞的整合解析出18个精细状态，这些状态组织为8个主要状态群和4个更广泛的程序，涵盖早期/增殖、前层级/前选择、层级/选择类固醇生成及排卵后/重塑状态。数据集限制性分析支持在多个来源中恢复这种共享的状态组织。Slingshot将早期/增殖和前层级状态朝向选择类固醇生成状态排序，早期/前选择标记物在类固醇生成标记物升高之前下降或达到峰值。在36个独立bulk文库中，早期/增殖和DNA复制程序在大黄卵泡中持续耗竭，而选择类固醇生成程序则增加。启动子可及性和Hi-C区室模式提供了阶段可变的调控背景。基于规则的多层评分将LHCGR、AMH和CYP11A1列为Tier 1候选基因。Tier 1和Tier 2基因集在局部ChickenGTEx GWAS信号上强于匹配的随机窗口。单个候选窗口信号仍低于全基因组和染色体显著阈值。这些结果建立了鸡卵泡选择的跨资源GC状态框架，并提名了一个聚焦的候选集，用于群体特异性功能验证。

在禽类卵巢生物学中，卵泡选择是维持产蛋母鸡分层排卵节律的核心事件。这一过程依赖颗粒细胞增殖、促性腺激素应答、类固醇生成激活以及排卵后重塑的协调变化。尽管已有单细胞及多组学研究刻画了颗粒细胞的异质性和调控景观，但不同数据集所推断的颗粒细胞程序是否跨资源稳定重现，以及这些程序是否得到独立转录组、染色质和性状遗传证据的支持，仍是尚未解决的问题。为此，研究人员整合了多个公共资源，旨在建立可靠的颗粒细胞状态框架，并评估其与卵泡选择和繁殖性状的关联。最终，该研究成功构建了跨资源的颗粒细胞状态图谱，明确了从增殖/前选择状态向类固醇生成状态的转变，并提名了可供后续功能验证的聚焦候选基因。

研究人员首先整合了来自GSE181756（芦花鸡，31周龄；小白卵泡SWF、F1和排卵后卵泡POF）和GSE291444（沐川乌骨鸡；前层级卵泡PHF和层级卵泡HF）的单细胞RNA-seq数据，经质控和Harmony批次校正后获得62,997个颗粒细胞。无监督聚类解析出18个精细状态，合并为8个主要状态群，并归纳为早期/增殖、前层级/前选择、层级/选择类固醇生成和排卵后/重塑4个程序。Slingshot拟时序分析以早期增殖状态为起点，确定了向选择类固醇生成状态分化的分支。独立bulk转录组数据来自PRJNA795703（南丹瑶鸡，22、31和51周龄；每年龄阶段SWF、小黄卵泡SYF和大黄卵泡LYF各4个生物学重复），共36个文库，用于验证标记程序的阶段依赖性。染色质可及性分析使用GSE181756的ATAC-seq峰值，三维基因组分析使用GSE167064的Hi-C区室PC1和TAD注释。遗传背景分析使用ChickenGTEx资源（商业纯系白洛克群体）中6个性状的GWAS汇总统计和eQTL记录。关键方法包括：单细胞整合与重聚类、Slingshot轨迹推断、标记程序评分及留一标记物和表达匹配随机基因集稳健性检验、启动子±2 kb ATAC重叠分析、20 kb区室PC1和TAD边界评估、±100 kb TSS中心窗口的GWAS扫描、匹配随机窗口富集检验，以及0–8分非GWAS证据域评分和分层。

研究结果部分：

整合的单细胞参考解析鸡卵泡阶段的颗粒细胞状态程序。通过整合两个单细胞数据集（GSE181756和GSE291444），构建了62,997个细胞的参考图谱，共解析出18个精细状态并归并为8个主要状态群。标记基因表达分析显示，增殖状态高表达TOP2A、UBE2C、RRM2和MCM2，前层级PHF状态表达AMH、FST、WT1、FSHR、INHBB和TGFB2，层级类固醇生成状态富集LHCGR、STAR、CYP11A1、HSD3B1、INHBA、NR5A1和NR5A2，而排卵后重塑状态表达PTGS2、THBS1、KLF6、LGALS3和S100A11。细胞组成分析表明，SWF以增殖状态为主，PHF富集WT1/FSHR+和INHBB/TGFB2+状态，HF和F1以类固醇生成状态为主，POF以重塑状态为主。Harmony校正增加了数据集间混合（平均iLISI由1.004升至1.145），同时基本保持了状态分离。跨数据集标记效应一致性中等（Spearman相关系数在精细状态为0.445–0.721，主要状态为0.326–0.699），数据集限制性重聚类也支持共享状态组织的可恢复性。

拟时序分析沿推断的卵泡选择分支排序颗粒细胞状态。利用Slingshot对52,621个细胞进行轨迹推断，以早期增殖GC为根，得到24,930个具有非缺失拟时序值的细胞。中位拟时序从早期增殖状态的3.31依次增加到WT1+ PHF的4.77、INHBB+ PHF的6.02、INHBB高表达PHF的10.00、PHF-HF过渡态的11.87、HF类固醇生成状态的15.52，最终到达选择类固醇生成状态的19.09。标记物动态显示，AMH随拟时序持续下降，FST、WT1和INHBB在早中期达到峰值，而LHCGR、STAR、CYP11A1和HSD3B1在后期升高，表明存在从早期/前选择程序向选择类固醇生成程序的转录转变。

独立bulk卵泡转录组支持阶段依赖性颗粒细胞标记程序。对36个bulk文库（PRJNA795703）进行标记程序评分，样本按卵泡阶段而非周龄分离。早期增殖GC评分在LYF中相比SWF显著降低（W22、W31和W51校正后P分别为0.0016、0.0034和0.0019），DNA复制早期GC也具有相同模式（校正后P=0.0019、0.0066和0.0040）。WT1阳性PHF GC评分在LYF中同样下降，而选择类固醇生成、IGFBP5阳性HF类固醇生成和重塑程序在LYF中趋于升高。留一标记物分析表明，早期增殖GC和DNA复制早期GC在所有年龄均满足方向保持和效应量保持标准，选择类固醇生成和IGFBP5阳性HF类固醇生成程序在W22和W51满足。各程序按年龄的严格稳健比例最高为50.0%–100%，进一步支持了主要程序的阶段依赖性。

染色质可及性和3D基因组特征为状态相关模块提供调控背景。启动子可及性分析显示，早期/增殖模块的基因在SWF和F1中有4/7的启动子存在ATAC峰，在POF中为2/7；PHF/前选择模块在F1中有2/6的启动子存在峰；HF/选择类固醇生成模块在F1中覆盖最高（6/7），POF/重塑模块在POF中覆盖最高（6/7）。Hi-C区室PC1分析显示，HF/选择类固醇生成模块在F1阶段PC1最高（均值2.14），POF/重塑模块在F1和POF中均高于SWF。TAD边界邻近基因主要集中于早期/增殖模块（SWF中3/6、F1中2/6、POF中4/6）。这些模式将状态相关模块置于阶段可变的染色质和三维基因组背景中。

多组学优先排序将颗粒细胞状态相关基因置于繁殖性状遗传背景中。研究人员设计了0–8分的非GWAS证据评分，包括状态模块、拟时序动态、bulk验证、启动子ATAC、ATAC阶段一致性、PC1动态、PC1阶段一致性和TAD边界邻近性。结合ChickenGTEx局部GWAS信号，LHCGR（7分）、AMH（6分）和CYP11A1（6分）达到Tier 1标准；另有9个基因列为Tier 2，8个列为Tier 3。匹配随机窗口富集分析显示，Tier 1和Tier 2的局部GWAS平均信号显著强于随机窗口（经验P=0.0090和0.00050），Tier 3无富集（P=0.539）。单个候选窗口的lead信号均未超过全基因组或染色体显著阈值。AMH的lead GWAS变异为AFE性状的28_2209821_G_A（-log₁₀(P)=4.126），距TSS 98,112 bp；CYP11A1的lead变异为EN300的10_3033943_T_A（-log₁₀(P)=3.376），距TSS 19,653 bp；LHCGR的lead变异为AFE的3_8220811_A_G（-log₁₀(P)=3.013），距TSS 10,209 bp。Tier 1基因还呈现不同的eQTL注释特征。值得注意的是，留一域敏感性分析显示，LHCGR在移除ATAC或PC1域后降为Tier 2，而AMH和CYP11A1在有任何支持域被移除时均不再保持Tier 1。

在讨论中，研究人员指出，所选颗粒细胞状态揭示了卵泡选择过程中由增殖/前层级状态向分化类固醇生成状态的身份重塑，这一转变在多个单细胞数据集和独立bulk转录组中一致重现，年龄差异主要影响后期类固醇生成程序的强度。染色质可及性和区室PC1的变化与状态程序激活在阶段上吻合，提示表观遗传重塑与转录程序转变的协调关系。LHCGR和CYP11A1先前已有性状关联报道，而AMH虽未在部分研究中显示与产蛋数关联，但在本分析中因其状态特异表达和调控背景而被优先。Tier 1和Tier 2的局部GWAS富集表明候选基因附近存在非随机的性状关联变异，但缺乏群体匹配的LD和共定位数据，遗传证据仍应视为位点水平。研究结论可归纳为：通过整合单细胞、bulk转录组、染色质和遗传资源，建立了鸡卵泡选择过程中颗粒细胞状态的跨资源框架，并提名了一个聚焦的候选基因集，为群体特异性功能验证提供了基础。