肿瘤内细菌的空间异质性与细胞定位特异性研究进展

《Cancer Science》：Advances in Spatial Heterogeneity and Cellular Localization Specificity of Intratumoral Bacteria

　　

肿瘤内细菌日益被认为是肿瘤微环境（TME）的组成部分，其生物学功能取决于特定微生物或微生物群落的定位与相对丰度。从直接基于组织样本的基因测序数据，到微生物活性代谢信号的检测、细胞-微生物互作、微生物的超微结构定位，这些均是对微生物组功能角色的不同推断方式，而“微生物存在与功能”的证据呈阶梯式递进。此外，目前大多数微生物检测方法单独使用均无法预测微生物的存活性、生物活性或功能特性。本综述比较了现有不同的微生物检测技术，并区分了三种空间范式：组织中的有序群落、细胞内细菌和细胞外细菌。我们总结了每种范式对信号转导、代谢、转移扩散、治疗耐药、抗肿瘤免疫及免疫治疗应答的影响。我们重点关注低生物量污染、批次效应、阴性对照、绝对定量和正交验证。最后，我们根据定位、生物学角色、临床证据、应用等方面对结果进行分类，同时区分人类患者的观察性研究与机制性及治疗性临床前研究。空间微生物学为肿瘤-微生物互作提供了有价值的信息，但具有临床可操作性的结论需要标准化分析、可重复的定位、存活性或活性评估，以及功能干扰实验来证明微生物效应，并需独立临床验证。

论文主体内容总结

1 引言

肿瘤相关微生物群作为定植于肿瘤组织的微生物群落，与肿瘤细胞、免疫细胞、基质细胞及细胞外基质和可溶性因子等非细胞成分共同构成肿瘤微环境（TME），参与肿瘤发生、免疫重塑、转移及治疗应答。大规模泛癌研究显示，大多数人类肿瘤组织中均可检测到细菌信号，但细菌的组成和分布因肿瘤类型而异。微生物在肿瘤中的不同空间和细胞定位可能导致不同的互作模式。例如，存在于恶性细胞内的细菌可能通过直接调控信号转导、细胞骨架、细胞代谢或抗原呈递来干扰肿瘤的发生与进展；位于上皮细胞间的细胞外细菌可能直接改变细胞间连接；聚集在缺氧、坏死、低灌注或免疫浸润区域的细菌则可能通过改变局部微环境来调节肿瘤生长。然而，许多肿瘤标本中微生物载量极低，来自试剂、石蜡处理、实验台表面及样本间交叉污染的DNA可能等于或超过真实微生物信号。此外，即使存在令人信服的空间信号，也不意味着微生物具有活性或引起了宿主表型。因此，微生物检测需要区分四个概念：检测、空间定位、存活性或活性、以及功能因果关系。

2 肿瘤内微生物空间定位的证据层级、检测策略与方法学挑战

2.1 肿瘤内微生物空间证据的五层框架及其生物学意义

肿瘤内微生物的空间证据可分为五个层级：第一层为组织水平，可在整个肿瘤或匀浆中检测到细菌DNA、RNA、抗原或代谢物；第二层为区域水平，信号可定位于缺氧、坏死、血管周围、边缘或特定区域；第三层为细胞邻域水平，微生物与由特定细胞构成的局部微环境相关联；第四层为细胞内水平，微生物可直接调控细胞信号；第五层为亚细胞水平，定位于细胞质、吞噬体/溶酶体及核周区域等特定区室。五个层级相互嵌套，不同层级代表对生物学状态的不同解读。组织水平显示过去对微生物的暴露，区域水平显示肿瘤对特定微生物的选择性生态位选择，邻域水平描述免疫排斥和代谢梯度等微区域现象，细胞内水平表明细菌可与宿主信号网络直接互作并逃避免疫清除，亚细胞水平则进一步区分作用位点。

2.2 肿瘤内细菌的空间检测技术

目前尚无单一平台能同时提供分类学信息、高空间分辨率、存活性评估、宿主状态测量和因果证据。16S核糖体RNA（16S rRNA）测序和宏基因组鸟枪法测序可提供群落组成和结构的总体信息，但会破坏组织架构。定量PCR（qPCR）和数字PCR（dPCR）能以高灵敏度检测特定DNA的绝对或相对含量，但不提供空间定位信息，属于“盲法”检测。培养法是活性的最直接证据，但对难培养、休眠、胞内或此前未表征的微生物不敏感，且可能选择性检测组织处理过程中引入的污染。显微镜技术可保留广泛的环境或分类群信息。荧光原位杂交（FISH）可鉴定特定细菌的RNA，免疫组织化学（IHC）可标记脂多糖等表面抗原并染色宿主细胞标志物以揭示细菌周围的免疫细胞类型。共聚焦显微镜可重建三维结构，电子显微镜可揭示隐藏在细胞器内的细菌超微结构，但这些方法通常只能检测少数已知细菌，无法进行全面的客观筛选，抗体也可能存在交叉反应。高多重成像平台扩展了这些能力，成像质谱流式和多重离子束成像可在细胞至亚细胞水平定量宿主和微生物抗原。多重容错荧光原位杂交（MERFISH）、CosMx空间分子成像和Xenium靶向多重转录本定位可在单细胞或亚细胞水平实现转录本定位，空间增强分辨率组学测序（Stereo-seq）则以高密度阵列捕获大组织。这些平台是为宿主转录本开发的，检测细菌转录本需要专门设计的探针，且细菌RNA较短、缺乏poly-A尾，还需处理组织自发荧光的干扰。

2.3 低生物量样本的方法学挑战与质控验证策略

肿瘤标本的微生物生物量远低于肠道，这构成了肿瘤内微生物组检测的瓶颈。从提取试剂盒、PCR试剂、水、石蜡、切片机表面到建库过程，细菌DNA均可能在各步骤引入。在低生物量条件下，污染物占主导地位并产生批次特异性结构。共识指南要求从采集到报告全程进行污染控制。严谨的研究应包含采样空白、提取空白、石蜡/玻片空白和PCR/建库空白，以及模拟群落或稀释系列等阳性对照，并在批次间随机化，尽可能设盲。绝对载量必须通过校准的qPCR、dPCR或显微镜进行测量，而非仅依赖相对丰度，同时应报告宿主DNA、组织质量、切片面积和检测限。计算过滤仅为辅助手段，不能替代对照。基于流行率的工具可标记阴性富集序列，但污染通常与输入DNA呈负相关，模拟稀释系列显示最佳过滤策略取决于生物量、对照和批次，因此通用黑名单或固定阈值不可行。由于真实低丰度类群可能被误判为污染物，而试剂污染物可能看似与肿瘤相关，正交验证必不可少：需通过FISH、RNAscope、qPCR或独立引物dPCR在第二个队列中确认类群；通过三维边界分析确认细胞内定位；通过培养、膜完整性、复制或代谢标记证实存活性；功能结论需基于微生物添加或去除、遗传扰动或代谢物挽救等因果设计。

3 肿瘤内微生物群的空间定位与功能意义

3.1 癌症特异性特征与肿瘤内空间异质性

肿瘤内微生物群的解读必须同时考虑两个同等重要但不可替代的尺度：癌症类型间的生态差异和单个肿瘤内的空间异质性。泛癌研究显示，即使在同一平台上，乳腺癌、结直肠癌、口腔/头颈肿瘤、肺癌和胰腺癌在绝对细菌载量、群落组成、优势分类群、细胞类型偏好和可检测比例方面均存在显著差异。癌症类型间的差异决定了信号的背景概率和可解读范围，而肿瘤内空间异质性决定了同一肿瘤中哪些区域、细胞邻域或区室实际承载更高的局部暴露。口腔、胃等黏膜表面肿瘤邻近高生物量微生物储库，屏障丧失、溃疡、生物膜形成及与腔内容物接触增加了进入机会；名义上低生物量器官中的肿瘤可能通过血行或淋巴播散、导管逆行扩散、屏障移位或由免疫细胞和恶性细胞携带而容纳微生物。进入肿瘤后，缺氧、坏死、低pH、营养释放、血管通透性异常、致密细胞外基质、局部免疫抑制及放疗、化疗或抗生素暴露可解释癌症类型间甚至同类型患者间的差异。

3.2 肿瘤组织学微结构对细菌空间分布的影响

肿瘤相关细菌的定位取决于组织结构及其自身生理特性。低氧张力、碎片堆积和灌注不足的缺氧及坏死区域通常是肿瘤相关细菌的偏好定植位点。血管和血管周围区域为肿瘤相关细菌提供营养和循环通路。纤维化或免疫活性区域形成物理和免疫屏障。例如，在口腔和结直肠肿瘤中，具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）在CD45+免疫区和上皮间空间中形成微菌落，这些区域通常以T细胞数量低和炎症或致癌转录程序为特征。乳腺癌研究显示细菌簇集中于缺氧和坏死区域，与活化T细胞、自然杀伤（NK）细胞等分离。实验性细菌治疗也倾向于具有区域特异性行为，如Clostridium novyi-NT芽孢优先在缺氧肿瘤组织中萌发以发挥抗肿瘤功能，基因工程改造的沙门氏菌（Salmonella）则根据其趋化和生长特性定植于血管、增殖或静止区域。肿瘤内细菌具有基于局部微环境特征的高度保守空间组织模式，空间定位是微生物群功能的重要前提。

3.3 肿瘤内细菌的组织特异性定位与亚细胞区室化

肿瘤内细菌不仅存在于肿瘤组织中，还分布于不同细胞类型中。2020年发表于Science的研究显示，大多数肿瘤内细菌存在于肿瘤细胞和免疫细胞中。细胞类型特异性在不同癌症类型间差异显著。乳腺癌细胞内的细菌数量高于正常乳腺细胞，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus）、乳杆菌（Lactobacillus）、链球菌（Streptococcus）和肠球菌（Enterococcus）等胞内细菌通过控制Toll样受体信号通路和重塑细胞骨架，帮助肿瘤细胞抵抗血流剪切应力并促进肿瘤播散。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）定位于乳腺肿瘤细胞的核周细胞质，其分泌的N-酰基高丝氨酸内酯阻断转化生长因子β（TGF-β）-Erb-B2受体酪氨酸激酶2（ERBB2）通路，损害曲妥珠单抗疗效。具核梭杆菌富集于恶性乳腺细胞的核周区域，改变与增殖和转移相关的RNA/蛋白质表达，同时激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路。肺癌空间转录组学显示恶性细胞中的细菌载量与多种致癌转录程序正相关。咽峡炎链球菌（Streptococcus anginosus）侵入胃癌细胞系，通过代谢精氨酸抑制抗肿瘤CD8+ T细胞，并通过转运体膜蛋白C-膜联蛋白A2（TMPC-ANXA2）互作激活致癌通路。具核梭杆菌侵入胃癌细胞，激活白细胞介素-17/核因子κB/v-rel网状内皮增生症病毒癌基因同源物B（IL-17/NF-κB/RelB）信号轴，募集肿瘤相关中性粒细胞并上调程序性死亡配体1（PD-L1）。肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）通过青霉素结合蛋白1B-Toll样受体4（PBP1B-TLR4）信号加剧肝细胞癌进展。胰腺癌细胞内的微生物增强宿主细胞运动性、细胞外基质（ECM）互作和免疫信号。具核梭杆菌在结直肠癌中不仅促进肿瘤起始，还与转移细胞共迁移以维持恶性状态，并诱导宿主细胞产生富含miR-1246/92b-3p/27a-3p及C-X-C基序趋化因子配体16/Ras同源家族成员A/白细胞介素-8（CXCL16/RhoA/IL-8）的外泌体加速转移。黑色素瘤中肿瘤细胞内的具核梭杆菌、Odontolyticus和Caprae可被机体识别为抗原。肿瘤内细菌也存在于免疫细胞中。口腔鳞状细胞癌中肿瘤细胞和免疫细胞内的乳杆菌和纤毛菌（Leptotrichia）丰度与NK细胞、PD-L1+内皮细胞和肿瘤相关巨噬细胞的浸润水平密切相关。食管癌和结直肠癌中，髓系细胞（尤其是单核细胞-巨噬细胞）内的细菌双向调控肿瘤细胞和髓系细胞中抗原呈递基因的表达。肝细胞癌中CD8+ T细胞内的微生物信号和巨噬细胞丰富区域的高微生物载量与患者术后生存相关。胰腺癌中脂多糖集中于基质或抑制性区室而非恶性细胞。结直肠癌中，具核梭杆菌代谢物丁酸盐在T细胞内被检测到，可能通过丁酸盐-组蛋白去乙酰化酶3/8-T盒转录因子21（HDAC3/8-TBX21）轴降低CD8+肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）上程序性死亡-1（PD-1）的表达。肿瘤内真菌也表现出癌症特异性细胞趋向性：在胰腺癌、乳腺癌和卵巢癌中，真菌主要存在于癌细胞中；在黑色素瘤和肺癌中，真菌主要存在于巨噬细胞中。在肝内胆管癌中，肿瘤组织内细菌通常位于恶性细胞的溶酶体中，而癌旁组织中细菌主要位于T细胞内，代表性菌种Paraburkholderia fungorum具有抗肿瘤作用。

3.4 肿瘤内的细胞外细菌群落

尽管肿瘤内细胞内细菌长期被认为驱动肿瘤调控，但近期研究表明细胞外细菌也发挥功能。乳腺癌中，肿瘤细胞外的细菌可诱导抗肿瘤功能的中性粒细胞亚群，激活免疫应答并抑制复发。在结直肠癌和口腔鳞状细胞癌中，富含细胞外细菌（尤其是具核梭杆菌）的区域细胞密度显著降低、增殖减弱、转录活性下降，这些细菌可使肿瘤细胞周期停滞并增加对5-氟尿嘧啶的耐药性。

3.5 不同空间结构模式间的生物学功能差异

肿瘤内细菌的空间定位可分为三种结构：空间有序群落、细胞内细菌和细胞外群落，每种代表不同的宿主互作模式和生物学后果。空间有序群落的主要作用在于重塑周围组织微环境，如免疫逃逸、炎症信号放大、代谢竞争或局部增殖抑制。细胞内细菌是最直接的宿主-微生物互作模式，细菌定植于恶性细胞中可直接开放宿主细胞的信号转导网络和细胞骨架，并为细菌提供逃避细胞外免疫清除的庇护所，使其得以随转移播散。具核梭杆菌在原发和转移性结直肠癌配对样本中持续检出，感染后的结直肠癌细胞可释放促转移外泌体。细胞外细菌定植于不同类型的细胞，具核梭杆菌等物种可破坏细胞间接触、引起G0-G1期阻滞、停止转录并增加对5-氟尿嘧啶的耐药性。同一细菌根据接触方式可诱导相反的免疫应答：乳腺癌模型中，细胞内细菌通过激活肿瘤细胞中的环状GMP-AMP合酶-干扰素基因刺激因子-白细胞介素-17B（cGAS-STING-IL-17B）通路将中性粒细胞重编程为免疫抑制细胞，而细胞外细菌暴露则促进抗肿瘤中性粒细胞活性。

4 从微生物定位到生物学与临床转化

4.1 微生物定位影响功能与治疗耐药的机制

细菌可影响受体信号转导、DNA损伤修复、细胞骨架重塑、自噬和代谢可用性等关键细胞过程。乳腺癌研究将细胞内细菌与转移存活和曲妥珠单抗耐药联系起来。胃癌中的咽峡炎链球菌直接将上皮侵袭与代谢重编程和致癌信号相连。结直肠癌中的具核梭杆菌在原发和转移灶中持续存在，促转移外泌体的释放提示肿瘤相关细菌可能支持肿瘤扩散。治疗耐药可通过至少四种空间上不同的机制产生：细菌对药物的直接代谢、恶性细胞中细菌信号的激活、细胞外定植引发的细胞静止、以及细菌生态位中免疫微环境的重塑。这四种机制对应不同的干预策略：细胞内细菌可能需要能穿透细胞膜的抗菌药物或宿主靶向治疗；细胞外细菌可能对局部递送的抗生素、噬菌体、生物膜破坏剂或诱导细胞周期逆转的药物敏感；以免疫抑制为主的微生态位可能需要免疫调节而非单纯的微生物清除。

4.2 肿瘤内细菌定位与免疫微环境

肿瘤免疫微环境由T细胞、B细胞、NK细胞、髓系细胞和各种基质成分组成。肿瘤内细菌可通过模式识别受体、核酸传感、代谢物、毒力因子和抗原呈递塑造该微环境，但免疫效应并非仅由物种决定，而取决于载量、活性、宿主细胞类型和空间位置。结直肠癌和口腔鳞状细胞癌富含髓系细胞、T细胞数量减少并存在免疫抑制。头颈鳞状细胞癌含有较高量的细菌，伴中性粒细胞、T细胞和耗竭特征。宿主细胞类型决定由哪种细胞启动免疫信号。细菌可在恶性细胞中激活趋化因子、PD-L1、抗原加工和细胞死亡程序等细胞内信号通路。乳腺癌模型中，侵入肿瘤细胞的细菌诱导免疫抑制性中性粒细胞，而细胞外暴露诱导相反效应。髓系细胞中的细菌信号可能是活跃感染或吞噬清除，后者持续重编程免疫功能。黑色素瘤细胞可将细菌来源的肽加载到人类白细胞抗原（HLA）分子上供T细胞识别。细胞质定位可能激活cGAS-STING等核酸识别通路，而内涵体或溶酶体定位触发Toll样受体激活、降解和抗原加工。细胞外定位通过微菌落、生物膜样结构和可溶性产物激活表面受体、补体和中性粒细胞。

4.3 肿瘤内细菌定位与免疫治疗

肿瘤内细菌可能通过改变抗原呈递、干扰素信号、髓系抑制、T细胞浸润和代谢竞争来影响免疫检查点阻断疗效，但当前证据表明其方向取决于肿瘤类型和定位。最强的人类证据来自头颈鳞状细胞癌，Silver等人发现较高的总肿瘤细菌载量与临床试验和独立验证队列中较差的免疫检查点阻断应答相关，机制模型显示增加肿瘤内细菌载量可增加中性粒细胞富集、T细胞耗竭和抗PD-L1耐受。在微卫星稳定型结直肠癌（MSS CRC）中，较高水平的细胞内具核梭杆菌与更好的抗PD-1应答相关，机制研究表明其代谢物可改善CD8+ T细胞功能。这些不一致的结果并非简单矛盾，而可能反映基线癌症特征、优势菌种、细菌载量、细胞内/细胞外状态和免疫细胞微环境的差异。肿瘤内细菌促进免疫治疗耐药的潜在机制至少包括：在缺氧或坏死区域形成以中性粒细胞和髓系抑制细胞为主的免疫屏障、激活恶性细胞中的致癌信号和免疫检查点程序、改变髓系细胞中的抗原呈递和炎症极化、以及通过细胞外菌落、代谢物和细胞静止降低效应T细胞接近或杀伤肿瘤的能力。另一方面，通过HLA呈递细菌抗原增强T细胞功能、细胞外免疫刺激或肿瘤抑制信号通路可能增加免疫治疗敏感性。目前肿瘤内细菌尚不能作为免疫治疗疗效的通用、独立且临床有效的生物标志物。

4.4 肿瘤内细菌与临床结局的关联

肿瘤内细菌与不同癌症类型患者的诊断、预后和治疗应答相关。幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）与胃癌、人乳头瘤病毒（HPV）与宫颈癌的关联已在多项研究中得到证实，两者的病原体检测已成为相应癌症风险管理和早期诊断体系的一部分。一项312例头颈癌患者的研究显示，高肿瘤细菌载量和低微生物多样性与头颈癌（尤其是HPV阴性亚型）的独立不良预后因素相关。多项临床队列研究显示高肿瘤细菌载量与免疫治疗耐药相关。一项507例手术治疗的肺癌患者研究显示，基于组织匀浆测序获得的平均丰度，高肿瘤细菌载量与总生存期和无复发生存期相关。结直肠癌中具核梭杆菌与较差生存和化疗耐药相关。胰腺癌中肿瘤内微生物组成可区分长期生存者和短期生存者。膀胱癌和微卫星稳定型结直肠癌中的细菌与PD-1阻断疗效相关并具有预测能力。然而，当前证据大多基于组织匀浆测序的平均丰度，难以建立因果关系，空间定位尚未纳入预后或预测模型，且尚无肿瘤内细菌生物标志物或疗法进入临床决策。

5 肿瘤内细菌空间定位的治疗转化：策略基础、证据层级与临床开发障碍

5.1 空间定位指导的治疗策略

基于空间信息的治疗可分为两种途径：利用外源工程细菌通过趋化性将载荷直接递送至肿瘤区域或直接杀伤肿瘤细胞，或基于内源肿瘤内细菌的定位进行消除、阻断或免疫利用。第一种途径依赖外源工程细菌的天然缺氧趋向性。厌氧和兼性厌氧菌株通常优先在低灌注、缺氧和坏死区域萌发或生长，在此释放局部细胞因子、毒素、酶、纳米材料或免疫刺激剂。然而，“区域靶向”仅显示细菌在基质或坏死中的扩散，并非“自动”实现向肿瘤细胞的递送。细胞外和细胞内状态对应不同的干预策略：细胞外细菌更适合局部抗菌药物、噬菌体、生物膜破坏剂、靶向细胞壁的抗体/纳米颗粒或在缺氧环境中激活的工程细菌载体；实际存在于恶性或免疫细胞中的细菌可能逃避细胞外抗体和某些抗生素，需要能穿透细胞的药物、调节宿主细胞自噬或溶酶体途径，或通过感染细胞的抗原呈递实现免疫清除。第二种途径直接利用内源肿瘤内细菌作为靶点或抗原来源。临床前研究表明，利用脂质体或纳米颗粒靶向递送抗癌药物以及多价抗菌疫苗可局部消除肿瘤细菌群体，或利用微生物作为抗原来源激活抗肿瘤免疫。然而，广谱消除可能清除对免疫治疗有益的细菌群体并改变肠道微生物组或正常组织，因此空间靶向干预是必要的。减毒沙门氏菌菌株VNP20009静脉给药后，仅部分患者肿瘤中观察到细菌定植，且未获得客观缓解。瘤内注射Clostridium novyi-NT芽孢可在缺氧肿瘤中萌发并引起局部溶瘤作用，但伴有感染和炎症风险。工程大肠杆菌Nissle菌株SYNB1891单次注射可诱导STING相关信号，但作为单药或与阿替利珠单抗联合尚未证实疗效。

5.2 临床开发障碍

细菌疗法的临床转化面临诸多挑战。即使在动物模型中已验证工程细菌的作用机制和疗效，递送效率仍是临床转化的主要瓶颈。口服途径受胃酸、胆汁、肠道微生物群竞争和上皮屏障限制；静脉注射涉及补体激活、吞噬清除和血管过滤；直接瘤内注射在深部、多灶性或转移性肿瘤中往往困难。即使细菌到达肿瘤部位，致密细胞外基质、高间质压、氧异质性和免疫清除仍可导致肿瘤内分布不均。人类药代动力学研究显示大肠杆菌Nissle及其衍生物在体内持久性有限且高度依赖微环境。定植稳定性和遗传可控性是第二个问题。在肿瘤环境的选择压力下，工程细菌可能丢失治疗元件、发生自发突变、水平基因转移甚至表型漂移。保护性设计应包括营养缺陷改造、杀伤开关、复制限制、抗生素救援、监测脱落和播散、遗传稳定性测试，生产过程也必须控制以确保活性、效力、纯度和批次一致性。缺乏稳定性不仅削弱治疗效果，还增加安全风险：败血症、持续感染、毒素释放、慢性免疫激活、耐药基因水平转移和意外的肠道菌群破坏。这些风险在粒细胞减少、黏膜损伤、胆道梗阻或免疫抑制患者中尤其高。在临床试验设计层面，应测量基线肿瘤内细菌载量、验证靶向意图、检测细菌活性和载量表达、追踪全身分布和清除动力学，并建立这些变量与药效学和临床终点之间的关联。