《Communications Biology》：Transcriptome of fetal cortex of tree shrew underlying the emergence of outer subventricular zone
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灵长类动物的一项定义性特征在于大脑皮层的扩张与复杂性增加，这些过程在很大程度上与富集神经祖细胞的外室下区（outer subventricular zone, OSVZ）的进化适应密切相关。然而，灵长类OSVZ出现的遗传机制仍不清楚。树鼩是比啮齿类更接近灵长类
灵长类动物的一项定义性特征在于大脑皮层的扩张与复杂性增加，这些过程在很大程度上与富集神经祖细胞的外室下区（outer subventricular zone, OSVZ）的进化适应密切相关。然而，灵长类OSVZ出现的遗传机制仍不清楚。树鼩是比啮齿类更接近灵长类的外群物种，其大脑呈现中间表型；尽管脑表面无脑回，但确实拥有OSVZ。本研究采用激光显微切割技术，对树鼩大脑三个关键发育阶段的不同皮层分层进行了全面的基因表达分析。研究结果表明，细胞周期相关基因已经参与树鼩OSVZ的调控；相反，细胞外基质相关通路似乎为灵长类OSVZ所特有。此外，过表达ZNF664可显著增加小鼠脑室下区中间前体细胞的增殖。综上所述，这些结果揭示了灵长类与树鼩在OSVZ发育中共有的分子机制，为理解灵长类皮层复杂性的起源提供了重要见解。
研究背景与目的：灵长类大脑皮层的扩张和复杂性增加是神经系统进化的标志性事件，这一过程与外室下区（outer subventricular zone, OSVZ）的扩张密切相关。OSVZ富含基底放射状胶质细胞（basal radial glial cells, bRGCs），后者具有更强的自我更新和增殖能力，被认为是驱动灵长类皮层扩增的关键细胞群体。然而，OSVZ起源和进化的分子机制仍不清楚。与啮齿类相比，中国树鼩（Tupaia belangeri chinensis）是更接近灵长类的外群物种；其大脑虽然无脑回，却具有与灵长类相似的OSVZ结构，因此被认为是研究灵长类皮层进化的重要过渡模型。该研究旨在通过对树鼩胚胎发育不同阶段皮层各层的转录组分析，揭示OSVZ出现和进化过程中共享及灵长类特有的分子程序。
主要研究内容与结论：研究人员利用激光捕获显微切割技术，系统分离并分析了树鼩胚胎E28、E37和E42三个关键发育阶段皮层各层（边缘区MZ、皮层板CP、中间带IZ、OSVZ、内室下区ISVZ、脑室区VZ）的转录组，构建了首个树鼩胎儿皮层板层基因表达图谱。主成分分析显示，神经富集层与祖细胞富集生发层明显分离，且OSVZ、ISVZ和VZ具有不同的转录特征。免疫荧光染色进一步证实，SOX2阳性祖细胞在E37时于OSVZ比例最高，提示E37是OSVZ发育的关键时期。基因表达动态分析表明，皮层神经元成熟过程中，突触相关基因在CP和IZ中呈线性上升，而神经发生相关基因呈下降趋势；OSVZ则持续富集神经发生和胶质发生相关程序，并表达多种灵长类oRG标志基因。单细胞RNA测序结果鉴定出放射状胶质细胞、迁移神经元、成熟神经元、小胶质细胞和脉络丛细胞等类型，并确认多数人类OSVZ相关基因已在树鼩ISVZ/OSVZ中表达。跨物种比较分析显示，细胞周期相关基因在树鼩OSVZ中已经活跃，而细胞外基质（extracellular matrix, ECM）相关通路主要富集于人类和猕猴的OSVZ，表明细胞周期调控早于灵长类分歧、ECM通路可能与灵长类OSVZ特异扩张有关。功能实验显示，在小鼠胚胎中过表达ZNF664可显著增加脑室下区中间前体细胞（intermediate progenitor cells, IPCs）的增殖，但不增加放射状胶质细胞数量，提示ZNF664在OSVZ相关祖细胞增殖中具有潜在作用。
主要技术方法：研究人员利用激光捕获显微切割（laser capture microdissection, LCM）获取树鼩胚胎E28、E37、E42皮层各层组织并进行RNA测序；对E38胚胎皮层生发区进行单细胞RNA测序；整合人类、猕猴、小鼠和树鼩的皮层分层转录组数据进行比较分析；通过免疫荧光染色验证细胞分布；在小鼠胚胎中采用宫内电穿孔（in utero electroporation, IUE）过表达ZNF664，并结合EdU和Ki67标记分析细胞增殖；利用siRNA在人SH-SY5Y细胞中敲低ZNF664验证其功能。
结果一：树鼩皮层板层转录图谱。通过LCM和RNA测序，研究人员获得E28、E37、E42三个时期的MZ、CP、IZ、OSVZ、ISVZ和VZ转录组数据；主成分分析表明PC1区分神经元富集层与祖细胞富集层，PC2主要区分发育阶段，且标志基因表达模式支持各层的身份。
结果二：胎儿皮层板层的层特异和阶段特异基因表达。免疫荧光显示SATB2阳性神经元向CP富集、BRN2阳性神经元处于迁移、TBR1阳性神经元限定于CP内侧；SOX2阳性祖细胞在E37达到高峰，且E37时OSVZ中SOX2阳性比例最高。差异表达基因和GO分析显示，VZ、ISVZ、OSVZ中持续高表达基因主要富集于细胞周期相关过程。
结果三：CP和IZ中呈线性变化的基因。CP和IZ中分别鉴定出123和234个表达持续上升的基因，主要富集于突触信号通路，如SCN2A和NOS1；分别有31和42个基因表达持续下降，富集于神经元分化和发育相关过程。
结果四：生发区差异表达基因。VZ的顶端祖细胞表达谱相对稳定；ISVZ中205个基因表达线性上升，富集于突触信号；OSVZ中240个基因表达上升，富集于神经发生、胶质发生及ECM相关通路，包括PI3K-Akt-mTOR信号通路，且其中13个人类OSVZ富集基因在树鼩、猕猴和人类中表达范围从VZ扩展到SVZ。
结果五：树鼩OSVZ基因表达的单细胞鉴定。E38生发区单细胞RNA测序鉴定出放射状胶质细胞、迁移神经元、成熟神经元等细胞类群；亚聚类分析识别出顶端放射状胶质细胞、基底放射状胶质细胞和IPCs。多数已报道的人类OSVZ特异基因在树鼩ISVZ/OSVZ中已有表达，其中TNC、PTPRZ1等oRG标志基因在基底放射状胶质细胞中高表达。免疫荧光定量显示，E39树鼩OSVZ中IPCs约占56.8%，其比例显著高于pan-RGCs和oRGCs。
结果六：树鼩与灵长类OSVZ基因表达的比较分析。比较人类、猕猴、树鼩和小鼠的生发层转录组发现，人类和猕猴OSVZ/ISVZ高表达基因主要富集于ECM组织结构相关通路；人类、猕猴和树鼩共有的OSVZ高表达基因则主要富集于细胞周期相关通路。ECM基因在小鼠和树鼩中主要表达于VZ，而细胞周期基因在树鼩、猕猴和人类中均在ISVZ和OSVZ中高表达。
结果七：ZNF664促进中间前体细胞增殖。多个锌指蛋白（ZNF）基因在人类、猕猴和树鼩的OSVZ和/或ISVZ中特异性高表达，而小鼠中表达极低。其中ZNF664在树鼩OSVZ和ISVZ中表达最稳定。小鼠宫内电穿孔实验显示，过表达ZNF664可显著增加VZ/SVZ中EdU阳性细胞比例，并使TBR2阳性IPCs比例提高1.413倍；EdU和Ki67标记进一步显示ZNF664促进IPCs进入增殖状态，但不增加放射状胶质细胞比例；siRNA敲低ZNF664降低人SH-SY5Y细胞增殖。
讨论与结论：该研究首次绘制了树鼩胎儿皮层各层发育过程中的全基因组表达图谱。研究显示，细胞周期相关基因在树鼩OSVZ中已经活跃，而ECM相关通路是灵长类OSVZ扩张中更为特异的分子特征。大多数OSVZ相关标志基因在树鼩与灵长类分歧前已经存在，提示这些分子程序的起源早于灵长类。ZNF664促进IPCs增殖的实验结果为理解ZNF基因在OSVZ进化中的作用提供了初步证据。综上，树鼩作为与灵长类亲缘关系较近且具有中间皮层表型的动物模型，可用于揭示OSVZ进化及灵长类皮层复杂性起源的遗传基础。
