《Journal of Extracellular Biology》：Comparative Assessment of Methods for Isolation and Imaging of Extracellular Vesicles
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来自特定细胞来源的细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）正成为具有治疗潜力的载体。单个细胞群体的EV和非EV分泌组也可用作细胞身份或状态的衡量标准。因此，EV属性和组成可能有助于定义细胞群体在药物测试、生物学模型和细胞治疗产品中的
来自特定细胞来源的细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）正成为具有治疗潜力的载体。单个细胞群体的EV和非EV分泌组也可用作细胞身份或状态的衡量标准。因此，EV属性和组成可能有助于定义细胞群体在药物测试、生物学模型和细胞治疗产品中的“适用性”质量。由此，需要具有成本效益的EV分离和严格表征的方法。研究人员旨在评估当前方法，并建立有效且可能改进的技术以满足这些需求。
首先，研究人员评估了超速离心、超滤和沉淀法作为从培养扩增的人间充质基质细胞（human mesenchymal stromal cell, hMSC）群体中分离EV的手段。其次，比较了传统的formvar和改进的lacey碳透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）网格制备。第三，评估了电子能量损失谱（electron energy loss spectroscopy, EELS）用于EV元素含量表征。第四，评估了动态光散射（dynamic light scattering, DLS）作为表征hMSC群体间EV尺寸分布差异的工具。最后，使用来自5位人类供体的28个培养扩增hMSC群体分离的EV群体，将DLS测量与直接TEM尺寸测量进行了比较。
超速离心在每次视觉TEM分析中最有效地提供了更高的EV纯度和产量。Lacey碳TEM网格为EV形态的视觉表征提供了最有效的成像，并实现了样品的持久存档以进行不连续评估。EELS鉴定了脂质双分子层中的磷，但无法有效鉴定EV的硫（蛋白质）和氮（蛋白质、RNA、DNA）含量。DLS在表征EV群体尺寸分布方面总体一致，但基于直接比较的TEM观察发现了差异和局限性。
本研究证明，超速离心、DLS尺寸表征以及用lacey碳TEM网格制备进行确认，可提供高质量的样品，并有效评估EV尺寸分布和形态。
细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）是细胞释放的纳米级膜性小泡，在细胞间通讯中发挥重要作用，并日益被视为潜在的药物递送载体和细胞状态标志物。单个细胞群体的EV和非EV分泌组可反映细胞身份或状态，因此EV的属性和组成可能用于评估细胞群体在药物测试、生物学模型及细胞治疗产品中的“适用性”。然而，目前EV分离和表征方法多样，包括基于密度、尺寸、沉淀和亲和的方法，文献中关于这些方法的产率和纯度比较多依赖相对评估，缺乏绝对数值标准。传统透射电子显微镜（TEM）制样通常涉及固定和负染色，可能破坏EV形态并引入碎片；动态光散射（DLS）作为间接测量技术，难以区分目标EV与碎片或聚集体。因此，开展本研究旨在系统比较不同EV分离和成像方法，建立更有效、可靠且成本可控的技术方案。
研究人员从培养扩增的人间充质基质细胞（hMSC）群体中收集条件培养基，平行采用超速离心、超滤和沉淀法分离EV，并通过TEM评估三种方法的纯度和产量。结果显示，超速离心在视觉分析中提供最高的EV形态保存和清洁度，脂质双分子层清晰可见。随后，研究人员比较了传统formvar碳网格（固定、负染）与自制的lacey碳网格（无固定、无染色）制备方法，发现lacey碳网格无需固定和染色即可清晰显示EV的脂质双分子层，且可见EV数量更多、尺寸多样性更大，样品在真空室温下保存至少一年仍无退化。在元素表征方面，利用电子能量损失谱（EELS）检测EV中的磷（脂质双分子层）成功，但未能有效检测硫（蛋白质）和氮（蛋白质、RNA、DNA），主要受磷峰与氯峰、碳峰重叠以及探测器光谱分辨率限制。在尺寸表征方面，DLS用于测量31个EV群体（来自5位供体的16个多克隆和15个单克隆hMSC群体），其中28个样本同时进行TEM测量并直接比较。结果发现，两种方法测得的总体平均直径无显著差异（DLS为161.1 nm，TEM为172.9 nm，p=0.341），但28个样本中有9个存在显著差异；DLS测量结果提示单克隆来源EV显著小于多克隆来源（p=0.049），而TEM数据不支持该结论（p=0.941）。通过直方图比较，两种方法在40–200 nm范围内识别的主要尺寸区间常相似，但DLS有时会探测到>200 nm的大颗粒，可能来自碎片或聚集体，而TEM可经直接观察排除此类干扰。
本研究采用的主要关键技术方法包括：①超速离心（差速离心至100,000×g）、超滤（100 kDa膜截留）和PEG/DEX沉淀法用于EV分离；②传统formvar网格（固定、负染）与自制lacey碳网格（无固定、无染色）用于TEM制样比较；③EELS在Titan3 G2 60–300 S/TEM上以300 kV采集光谱，用于元素组成分析；④DLS（Wyatt Technologies Mobius）每样本采集15次、每次30秒读数；⑤28个EV样本的TEM图像通过ImageJ测量每个EV的费雷特直径，每样本盲测100个EV，并与DLS结果进行Welch t检验。样本队列来源为5位人类供体的培养扩增hMSC群体，其中16个为多克隆（CEM）、15个为单克隆（PBS），分别取自第3代和第5代培养。
研究结果分述如下：
**3.1 EV分离方法**：通过TEM在lacey碳网格上视觉比较，超速离心产生的样品最干净、产量高，且EV脂质双分子层形态保存良好；超滤样品可见EV但存在残留培养基形成的粘性膜状物；沉淀样品除粘性膜外还有额外碎片。因此，超速离心被选为后续研究的标准分离方法。
**3.2 传统formvar与简化lacey碳TEM网格制备比较**：lacey碳网格无需固定或负染，所得TEM图像中EV边界清晰、脂质双分子层明显，且单位视野内EV数量更多、尺寸分布更广；而formvar网格制备的样品中EV较小、双分子层模糊，周围碎片较多。此外，lacey碳制备的样品在储存1个月和1年后重复成像未见退化，表明其可用于样品长期存档和不连续评估。
**3.3 EELS评估EV元素组成**：EELS在132 eV附近检测到磷峰，对应脂质双分子层；但未能在165 eV处检测到硫（蛋白质）峰，也未能检测到402 eV处氮（蛋白质、RNA、DNA）峰，原因可能是磷峰（160 eV）、残留PBS产生的宽氯峰（200 eV）以及lacey碳网格产生的碳峰（284 eV）重叠，且受探测器光谱分辨率限制。
**3.4 TEM与DLS测量EV尺寸和变异的比较**：对31个EV样本进行DLS测量，其中28个成功获得TEM数据。整体平均直径在两种方法间无统计显著差异（p=0.341），但个体样本比较中，19个无显著差异、9个显著差异（其中7个TEM均值较大，2个较小）。DLS提示克隆EV小于多克隆EV（p=0.049），但TEM显示两者无差异（p=0.941）。直方图分析显示，在50 nm分箱下，EV主尺寸范围常见于40–200 nm区间，但DLS有时出现>200 nm的亚群，可能代表聚集体或碎片，而TEM可直接排除这些干扰。
在讨论部分，作者总结了超速离心的优势与文献一致，同时指出了其设备昂贵、耗时约3小时、可能共分离小型外泌体等局限性。Lacey碳网格被强调为首创的EV TEM制备方法，具有省时（<5分钟）、高清晰度、可存档等优点，但样品对电子束较敏感，需在60–80 kV下观察。EELS不是本研究的核心手段，其灵敏度受样品制备和光谱重叠限制，但磷检测仍可作为EV完整性验证的指标。DLS快速便捷，适合大规模筛查，但因其间接测量原理无法排除碎片和聚集体，应与TEM结合使用。研究结论部分翻译如下：
**结论**：EV可能作为细胞群体生物学状态或功能属性的读出手段，也可能发展为独立的治疗载体。本文为hMSC来源EV群体的分离和表征提供了有效方法，这些发现很可能适用于许多其他细胞来源的EV。研究证明，超速离心是EV分离中产率和纯度较高的最有效方法之一，并应通过EV生物标志物分析进一步确认。研究人员首次报道了无需固定、染色或冷冻电镜的lacey碳TEM网格制备方法，用于EV的成像和评估，为EV形态评估提供高效手段，并支持样品的持久存档，应当被视为未来TEM制备的首选方法。TEM图像是评估EV尺寸和形态最直接、最可靠的方法，未来需要自动化图像分割和分析技术以减少人工操作。DLS是一种成本较低、资源需求少的测量手段，可用于估算EV尺寸，但作为间接测量方法易受碎片和聚集体干扰，必须用TEM进行验证。EELS方法并非本分析的关键，其应用受分辨率限制及氯和碳污染峰影响，但通过改进样品制备可能提高分辨率。
