《Neurobiology of Disease》：Matrix metalloproteinase-9 is associated with CX3CL1 on tau and amyloid biomarker pathways in APOE4 carriers
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APOE ε4携带者相较于非携带者表现出增强的促炎反应和小胶质细胞失调。CX3CL1是一种参与小胶质细胞信号传导和阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）的生物标志物，可被基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinas
APOE ε4携带者相较于非携带者表现出增强的促炎反应和小胶质细胞失调。CX3CL1是一种参与小胶质细胞信号传导和阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）的生物标志物，可被基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）等蛋白酶切割，而MMPs与记忆和血管重塑相关。研究人员检测了MMP-9在APOE ε4携带者（APOE4+）与非携带者（APOE4-）中参与CX3CL1与脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）淀粉样蛋白和tau生物标志物关联通路中的作用，并进一步检测了APOE4分组与炎症谱之间的关联。CSF样本采集自115名认知未受损的、符合退伍军人事务部（VA）资格的退伍军人，这些受试者参加了二十碳五烯酸的脑淀粉样蛋白与血管效应（Brain Amyloid and Vascular Effects of Eicosapentaenoic Acid, BRAVE）研究（NCT02719327）。研究发现，与APOE4-携带者相比，APOE4+携带者的Aβ42和Aβ42/Aβ40水平较低。此外，APOE4+参与者的p-tau217水平高于APOE4-参与者；然而，两组携带者之间的p-tau217/tau比值无显著差异。在有调节的中介模型中，仅在APOE4+携带者中，MMP-9中介了CX3CL1对Aβ42/Aβ40、p-tau217/tau和p-tau217/Aβ42的影响。最后，研究人员发现CX3CL1与复合促炎z评分之间存在相关性，并且APOE4+组的ICAM-1和VCAM-1基线水平较低。然而，在APOE4-组中，CX3CL1与抗炎z评分相关，这表明CX3CL1在APOE4+携带者与非携带者中具有不同的炎症作用。这些发现表明，MMP-9与CX3CL1的关联在APOE4+携带者的tau和淀粉样蛋白调节中发挥独特作用，并且认知未受损的APOE4+个体可能早期即出现免疫系统失调。
**论文解读文章**
**一、研究背景与科学问题**
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是老年人痴呆的主要病因之一，其神经病理学特征为淀粉样蛋白（amyloid-beta, Aβ）富集的神经炎性斑块和过度磷酸化tau蛋白为基础的神经原纤维缠结的脑内积聚。载脂蛋白E（apolipoprotein E, APOE）ε4等位基因是AD最强的遗传风险预测因子。与APOE ε4非携带者相比，ε4携带者表现出加速的认知衰退和神经功能改变，并呈现加剧的促炎反应和小胶质细胞失调。在AD病理进程中，淀粉样蛋白病理通常先于tau病理出现，脑脊液（cerebrospinal fluid, CSF）中Aβ42或Aβ42/Aβ40的降低以及苏氨酸217位点磷酸化tau（p-tau217）或苏氨酸181位点磷酸化tau（p-tau181）的升高可预测AD进展。NIA-AA标准依据淀粉样蛋白（A）、tau（T）和神经退行性变（N）状态对个体因AD导致的生物学变化进行分期，其中Aβ42/Aβ40和p-tau217/Aβ42等比值与淀粉样蛋白PET阳性（A+）高度相关，被认定为核心1（即症状前期）生物标志物。
CX3CL1（又称fractalkine）是一种由神经元表达的趋化因子，通过作用于小胶质细胞上的受体CX3CR1来抑制小胶质细胞活化，发挥抗炎作用。CX3CL1-CX3CR1通路的失调已被发现与AD等神经退行性疾病中的tau和淀粉样蛋白病理有关。膜结合型CX3CL1可被蛋白酶（如基质金属蛋白酶，matrix metalloproteinases, MMPs）切割产生可溶性形式，从而减弱CX3CL1-CX3CR1的激活。MMP-9（又称明胶酶B）是锌依赖性内肽酶家族成员，不仅可与CX3CL1相互作用，还能切割淀粉样蛋白和tau蛋白。然而，在认知未受损的APOE ε4携带者中，MMP-9与神经退行性疾病相关生物标志物之间的关联尚存在关键知识空白。因此，本研究旨在探索认知未受损的APOE ε4携带者中，CX3CL1通路相关的tau和淀粉样蛋白病理是否失调，以及ε4等位基因的存在是否导致炎症谱差异。
**二、研究设计与核心结论**
研究人员开展了一项基于BRAVE研究（NCT02719327）的横断面探索性分析，纳入115名年龄50-76岁、符合VA资格的认知未受损退伍军人，所有受试者均完成了基线CSF采集。参与者按是否携带至少一个APOE ε4等位基因分为APOE4+携带者（n=29）和APOE4-非携带者（n=86）。研究检测了CSF中包括Aβ42、Aβ40、p-tau217、p-tau181、总tau、CX3CL1、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2、ICAM-1、VCAM-1、GFAP、TREM2及多种炎症因子在内的生物标志物水平，并构建了促炎和抗炎复合评分。
研究发现，APOE4+携带者组中Aβ42水平和Aβ42/Aβ40比值显著低于非携带者，p-tau217和p-tau217/Aβ42比值显著高于非携带者；但p-tau217/tau比值在两组间无显著差异。MMP-9仅在APOE4+组中与CX3CL1显著相关。有调节的中介模型分析显示，APOE4携带状态显著调节CX3CL1→MMP-9通路（路径a），以及MMP-9→p-tau217/tau、Aβ42/Aβ40和p-tau217/Aβ42的路径（路径b）。在APOE4+携带者中，MMP-9显著中介了CX3CL1对p-tau217/tau（间接效应=-0.025，95%CI:-0.053至-0.002）、Aβ42/Aβ40（间接效应=-0.044，95%CI:-0.079至-0.011）和p-tau217/Aβ42（间接效应=0.074，95%CI:0.009至0.139）的影响，且这些中介效应的调节指数均达显著水平。炎症分析方面，APOE4+组中CX3CL1与促炎复合评分呈显著正相关（β=0.618，p=0.001），而APOE4-组中CX3CL1与抗炎复合评分呈显著正相关（β=0.335，p=0.002）。此外，APOE4+组CSF中ICAM-1（p=0.005）和VCAM-1（p=0.009）水平显著低于APOE4-组。上述发现表明，MMP-9与CX3CL1的关联在APOE4+携带者的tau和淀粉样蛋白调节中发挥独特作用，且认知未受损的APOE4+个体可能已出现早期免疫系统失调。
**三、关键技术与方法**
本研究采用了多种关键技术手段，样本来源于多中心随机对照试验BRAVE研究的基线CSF标本。主要技术方法包括：（1）采用Meso Scale Discovery（MSD）U-Plex平台的自定义多因子检测法，对CSF中MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2进行多重定量；（2）使用Roche Elecsys?平台单因子免疫分析法检测p-tau181和总tau；（3）应用核酸连接免疫三明治测定测序（NULISAseq）CNS疾病面板120（Alamar Biosciences）定量检测包括可溶性CX3CL1在内的120余种中枢神经系统蛋白生物标志物；（4）APOE基因分型采用标准流程从全血中测定；（5）统计分析采用单变量一般线性模型、线性回归和基于SPSS PROCESS Model 59的有调节中介分析以及R语言Lavaan包的分层中介模型，所有模型均校正年龄和性别。
**四、主要研究结果**
**4.1 APOE4-与APOE4+携带者基线生物标志物水平差异**
通过校正年龄和性别的单变量一般线性模型比较发现，APOE4+组Aβ42水平显著低于APOE4-组（p<0.001），Aβ42/Aβ40比值亦显著降低（p<0.001）；APOE4+组p-tau217水平显著升高（p=0.047），p-tau217/Aβ42比值显著升高（p<0.001）。然而，p-tau217/tau比值在两组间无显著差异。此外，APOE4+组ICAM-1（p=0.005）和VCAM-1（p=0.009）水平显著低于APOE4-组。其余分析物及比值在两组间未见显著差异。
**4.2 APOE4-携带者CX3CL1与tau和淀粉样蛋白的关联**
在APOE4-组中，CX3CL1与p-tau217（β=0.423，p<0.001）、总tau（β=0.522，p<0.001）、Aβ40（β=0.829，p<0.001）和Aβ42（β=0.721，p<0.001）均呈显著正相关，与p-tau217/total tau（β=-0.518，p<0.001）和p-tau217/Aβ42（β=-0.274，p=0.012）呈显著负相关。
**4.3 APOE4-携带者MMP-9与tau和淀粉样蛋白的关联**
在APOE4-组中，MMP-9与p-tau217、总tau、Aβ40、Aβ42、Aβ42/Aβ40及p-tau217/Aβ42均无显著相关性，仅与p-tau217/total tau呈显著负相关（β=-0.206，p=0.043）。
**4.4 APOE4-携带者中介分析**
在APOE4-组中，未发现MMP-9对CX3CL1与p-tau217、p-tau217/total tau或Aβ42/Aβ40之间关系存在显著间接效应。但CX3CL1对p-tau217和p-tau217/total tau的受控直接效应和总效应显著。
**4.5 APOE4-携带者炎症与GFAP分析**
APOE4-组中，CX3CL1与促炎复合评分无显著相关性（p=0.168），但TREM2与促炎复合评分呈正相关（β=0.238，p=0.025）。CX3CL1（β=0.335，p=0.002）和TREM2（β=0.341，p=0.002）均与抗炎复合评分呈显著正相关。CX3CL1与GFAP呈正相关（β=0.344，p=0.001）。
**4.6 APOE4+携带者CX3CL1与tau和淀粉样蛋白的关联**
在APOE4+组中，CX3CL1与p-tau217（p=0.134）和总tau（p=0.057）无显著相关性，与p-tau217/total tau呈显著负相关（β=-0.419，p=0.038），与Aβ40呈显著正相关（β=0.718，p<0.001），但与Aβ42、Aβ42/Aβ40和p-tau217/Aβ42均无显著相关性。
**4.7 APOE4+携带者MMP-9与tau和淀粉样蛋白的关联**
APOE4+组中，MMP-9与p-tau217（β=0.683，p<0.001）、总tau（β=0.752，p<0.001）和Aβ40（β=0.546，p=0.007）均呈显著正相关，与p-tau217/total tau（β=-0.699，p<0.001）和Aβ42/Aβ40（β=-0.543，p=0.018）呈显著负相关，与p-tau217/Aβ42呈显著正相关（β=0.591，p=0.008）。
**4.8 APOE4+携带者中介分析**
在APOE4+组中，MMP-9显著中介了CX3CL1与p-tau217、p-tau217/total tau和Aβ42/Aβ40之间的关联。CX3CL1对上述结果变量均无显著的受控直接效应。
**4.9 APOE4+携带者炎症与GFAP分析**
APOE4+组中，CX3CL1（β=0.618，p=0.001）和TREM2（β=0.770，p<0.001）均与促炎复合评分呈显著正相关，但二者与抗炎复合评分均无显著相关性。CX3CL1与GFAP呈正相关（β=0.505，p=0.008）。
**五、讨论与结论**
讨论部分指出，APOE4+携带者在认知未受损阶段即表现出Aβ42、p-tau217、p-tau217/Aβ42、Aβ42/Aβ40、ICAM-1和VCAM-1等CSF生物标志物的显著差异，提示AD高风险人群的细胞微环境在认知功能变化之前已发生改变。在APOE4+携带者中，MMP-9与CX3CL1在tau和淀粉样蛋白调节通路中协同作用，MMP-9可能以牺牲淀粉样蛋白清除为代价来降低217位点tau磷酸化。这一关系在APOE4-非携带者中不存在，提示靶向MMP-9可能作为ε4携带者AD症状出现前的潜在治疗策略。炎症谱分析显示APOE4+携带者呈现极化促炎表型，TREM2和CX3CL1均与促炎复合评分相关而与抗炎评分无关联，而APOE4-组则呈抗炎倾向。ICAM-1和VCAM-1在APOE4+组中降低可能涉及CypA-NF-kB-MMP-9通路的差异调节。结论总结如下：研究发现APOE4-与APOE4+无症状携带者之间CX3CL1通路存在显著差异，MMP-9在ε4携带者中介了CX3CL1对tau和淀粉样蛋白生物标志物通路的影响，并抑制tau蛋白217位点磷酸化但可能以促进淀粉样蛋白病理为代价。研究还发现携带ε4等位基因者CSF中Aβ42、p-tau217、Aβ42/Aβ40、p-tau217/Aβ42、ICAM-1和VCAM-1水平均存在显著差异，其炎症谱呈现极化促炎表型，表明APOE4+携带者在AD症状出现前已具有不同的基线微环境。这些发现将MMP-9确定为APOE ε4携带者中值得进一步研究的临床前期干预靶点。
