人类iNeurons全基因组CRISPRi筛选鉴定与局灶性皮质发育不良相关的新型mTOR负调控因子基因

《Neurobiology of Disease》：Genome-wide CRISPRi screen in human iNeurons identifies novel negative mTOR regulator genes associated with focal cortical dysplasia

　　

局灶性皮质发育不良（FCD）是局灶性癫痫的常见原因，通常由mTOR细胞信号通路中的脑嵌合突变引起。为了鉴定新的潜在FCD基因，研究人员开发了一种在人类神经元中进行的体外CRISPRi筛选，并使用基于FCD生物标志物——磷酸化S₆核糖体蛋白（pS₆）的FACS富集。利用全基因组（110,000个gRNA）和候选（129个gRNA）文库，研究人员发现了6个功能缺失显著升高pS₆水平的新基因：LRRC4、EIF3A、TSN、HIP1、PIK3R3和URI1。对mTOR通路的进一步分析显示，只有其中两个基因PIK3R3和HIP1导致了整个AKT/mTOR/S₆信号通路的过度磷酸化。重要的是，这两个基因的潜在致病变异已分别在一名FCD患者的切除脑组织中被报道，支持了该筛选的预测效度。在iNeurons中敲减这6个基因中的每一个均使mTOR信号对神经营养因子信号缺失（特别是GDNF）产生抵抗；即使没有GDNF，pS₆水平仍与经GDNF刺激的对照组相当。因此，研究人员鉴定了在失去神经营养因子支持背景下的神经元mTOR信号负调控因子。这些数据扩展了可能在神经元中调控mTOR通路信号的基因集合，为在人类组织中鉴定的候选基因提供了生物学确认，并为研究切除的FCD组织中的体细胞基因变异提出了额外靶点。使用iNeurons鉴定新的mTOR调控因子也凸显了在疾病相关细胞类型中进行遗传筛选的重要性。

局灶性皮质发育不良（FCD）是局灶性癫痫的常见原因，其中FCD II型以皮质神经元分层紊乱、神经元肥大或畸形以及mTOR通路下游S₆核糖体蛋白磷酸化（pS₆）升高为特征。近年来，FCD II型标本中已发现mTOR信号调控基因的嵌合变异，但由于变异等位基因分数低、外周组织难以检出，且良性体细胞变异丰富，从患者组织中鉴定新FCD基因极其困难。为此，研究人员假设部分未获遗传诊断的FCD病例携带未知mTOR/pS₆调控基因的体细胞突变，并以人诱导多能干细胞（iPSC）来源的诱导神经元（iNeuron）和CRISPR干扰（CRISPRi）技术建立了体外筛选平台，以pS₆为生物标志物，通过荧光激活细胞分选（FACS）鉴定候选基因。该筛选未采用营养剥夺条件，并聚焦负调控因子，与既往在永生化细胞中的mTOR筛选不同。

研究人员使用KN-5 iPSC系，通过稳定整合多西环素诱导的KRAB-dCas9和NGN1/2生成CRISPRi iNeuron。先用覆盖已知mTOR调控因子的测试文库确认筛选可行性，再进行全基因组（110,000个gRNA）和候选（129个gRNA）文库筛选。在pS₆-high细胞中富集的gRNA多为已知负调控因子基因如DEPDC5、TSC1、PTEN，而在pS₆-low中富集的为MTOR等正调控因子。鉴定出6个敲减后显著升高pS₆的新基因：LRRC4、EIF3A、TSN、HIP1、PIK3R3和URI1。进一步通路分析显示，仅PIK3R3和HIP1导致AKT/mTOR/S₆信号通路整体过度磷酸化；已报道各有1例FCD患者切除脑组织中含有这两个基因的潜在致病变异，支持筛选的预测效度。敲减这6个基因均使iNeuron的mTOR信号对GDNF缺失产生抵抗，即在无GDNF时pS₆水平仍与GDNF刺激的对照组相当。这些结果说明，这些基因是在失去神经营养因子支持背景下神经元mTOR信号的负调控因子。

在技术方法上，研究主要采用了：CRISPRi系统（KRAB-dCas9）在转录起始位点附近抑制转录以实现基因敲减；慢病毒文库转导iNeuron，结合FACS分选pS₆-high与pS₆-low群体后行下一代测序（NGS）并计算log2富集；细胞内western（ICW）和常规免疫印迹验证蛋白表达与磷酸化水平；高含量共聚焦显微镜结合神经元胞体分割分析评估单个细胞pS₆和胞体大小。样本来源方面，研究使用KN-5 iPSC系，未纳入独立患者队列，而是引用已发表的FCD患者脑组织测序数据进行变异验证。

结果部分：

3.1 CRISPRi iNeuron iPSC系生成。通过qRT-PCR和免疫印迹确认CRISPRi可高效敲减目标基因（如SMC1A蛋白下降86%），为筛选提供了可靠系统。

3.2 丢失DEPDC5表达增加S6磷酸化。在iNeuron中敲除DEPDC5或使用CRISPRi敲低均使pS₆升高，表明该系统能重复出FCD II生物标志物的变化。

3.3 已知mTOR调节因子文库筛选。测试文库筛选后，已知负调控因子DEPDC5、TSC1、PTEN在pS₆-high中富集，正调控因子RPS6KB1、MTOR在pS₆-low中富集，中性对照接近均值，验证了筛选方法的特异性和敏感性。

3.4 全基因组和候选CRISPRi