肠道蠕虫通过重塑树突状细胞发育以拮抗抗蠕虫免疫应答

《Mucosal Immunology》：Intestinal helminths skew dendritic cell development to counter the anti-helminth immune response

　　

摘要专业翻译 肠道树突状细胞（dendritic cell, DC）协调适应性免疫应答，在抵御病原体与维持对无害抗原的耐受之间维持平衡。然而，支撑这一功能双重性的分子机制在很大程度上仍属未知。Heligmosomoides polygyrus bakeri（Hpb）是一种小鼠自然感染的寄生虫，以其独特的免疫逃逸策略对抗宿主保护性免疫为特征。在本研究中，研究人员利用这一独特的感染环境来研究DC维持免疫平衡的机制。对Hpb感染期间肠道DC的深入表征揭示，出现了驱动保护性Th2应答的DC亚群，以及具有免疫调节特性的其他DC亚群。研究人员还发现，肠道DC向免疫调节功能的偏移是由内源性来源的TGFβ信号传导以及Hpb产生的TGFβ模拟分子（TGFβ-mimic, TGM）所介导。因此，本研究结果从机制上解释了Hpb调节适应性免疫系统的能力。此外，这些数据提供了一个例证，说明DC区室内的异质性如何决定促炎与抗炎免疫应答的同时产生。

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一、研究背景与科学问题

肠道树突状细胞（dendritic cell, DC）是适应性免疫应答的关键调控者，在抵御病原体感染与维持对无害抗原的免疫耐受之间发挥平衡作用。然而，支撑DC这一功能双重性的分子机制长期未明。Heligmosomoides polygyrus bakeri（Hpb）是一种在小鼠中自然发生的胃肠道线虫，其生活史独特：幼虫在感染后约2天穿透肠壁进入肠壁组织，经历必需的成熟阶段后，约在7天再次穿出肠壁进入肠腔发育为成虫。在这一过程中，Hpb通过分泌多种免疫调节分子（如TGFβ模拟分子TGM、IL-33受体ST-2的激动剂或拮抗剂）直接调控宿主免疫应答，形成了抗蠕虫免疫应答与蠕虫免疫调节策略相互对抗的独特免疫场景。

然而，关于Hpb感染原发部位——小肠固有层（small intestine lamina propria, SI LP）中免疫细胞的研究极为有限，主要原因在于Hpb感染引起的肠道组织结构改变和黏液分泌增加使得从黏膜中分离活细胞十分困难。此前对肠道DC在Hpb感染中作用的认识主要来源于引流淋巴结的实验，而非感染部位本身。此外，虽然已知DC2亚群（cDC2）在其他2型免疫应答模型中参与效应性Th2细胞的初始激活，但DC2在小肠中具有高度异质性，可根据CD103表达分为两个主要亚群，二者在不同类型免疫应答中的相对贡献尚不清楚。DC2在特定情境下也可驱动由CD4?调节性T细胞（Treg）介导的免疫耐受。更为关键的是，肠道DC是否也是Hpb免疫调节的直接靶点，此前完全未知。

基于上述背景，本研究旨在利用Hpb在同一感染过程中同时驱动效应性和耐受性CD4?T细胞应答的独特能力，系统研究适应性免疫应答演变过程中肠道DC的行为，揭示Hpb调节宿主保护性免疫的分子机制。

二、研究内容与主要结论

研究人员利用前期开发的新型细胞分离方案，对Hpb感染前14天内SI LP中的DC进行了深入的动态表征，涵盖丰度、表型、功能、转录谱和空间定位等多个维度。研究发现，Hpb感染导致肠道DC区室发生显著改变，DC2两个亚群（CD103?DC2和CD103?DC2）在感染过程中呈现动态变化，且在感染第7天（7DPI）变化最为显著。表型分析显示，CD103?DC2在感染后获得促炎性和Th2极化特征（CD40、CD301b、IRF4、PD-L2等表达上调），而CD103?DC2则维持相对未成熟和调节性表型（CD101高表达、CD80和CD86低表达）。功能实验证实，CD103?DC2在感染后驱动更强的T细胞活化和Th2相关细胞因子（IL-13、IL-10等）产生，而CD103?DC2则保持诱导Foxp3?Treg分化的能力，且视黄酸（retinoic acid, RA）产生能力显著增强。

通过分离Hpb肉芽肿邻近组织和非肉芽肿组织中的细胞，研究人员发现DC2的表型和功能差异与细胞相对于虫体肉芽肿的空间位置密切相关。转录组分析进一步证实，肉芽肿邻近的CD103?DC2富集了与2型免疫应答相关的DC转录特征，而CD103?DC2则呈现未成熟转录谱。研究人员进一步鉴定出TGFβ信号通路是驱动DC2功能分化的关键分子机制：Hpb产生的TGM可直接结合DC上的TGFβ受体，CD103?DC2和DC1对TGM的结合能力显著高于CD103?DC2。体内阻断TGFβ信号（使用pan-TGFβ抑制剂SB431542）后，CD103?DC2数量减少，DC2亚群中Th2应答相关标志物（CD301b、PD-L2）表达增加，sMLN中Th2细胞数量和比例显著上升，且Hpb产卵量（繁殖力）显著降低。体外实验证实，TGFβ或TGM处理可使DC前体细胞（pre-DC）和骨髓来源DC（BMDC）向未成熟、调节性表型偏移（MHCII、IRF4、CD80下调，IRF8、CD103上调），并降低其刺激T细胞增殖和活化的能力。

三、关键技术与方法

本研究采用了以下核心技术方法：一是基于酶消化和组织分离的新型方案从Hpb感染小鼠SI LP中分离活细胞；二是流式细胞术（flow cytometry）对DC亚群进行鉴定、分选和表型分析，包括CD103和CD11b标记区分DC1、CD103?DC2、CD103?DC2和双阴性（DN）细胞；三是体外OT-II/OVA共培养系统评估DC亚群驱动T细胞增殖、活化和分化的功能；四是ALDEFLUOR?实验检测DC的醛脱氢酶（ALDH）活性以评估RA产生能力；五是bulk RNA测序（RNA-seq）对肉芽肿邻近和非肉芽肿区域分离的DC2亚群进行转录组分析；六是CYCLOPS成像分析流程将免疫荧光成像数据转化为FACS兼容文件进行单细胞表型分析；七是体内药理学干预（SB431542抑制剂和抗TGFβ抗体）结合寄生虫学指标（成虫数、粪便虫卵数、繁殖力）评估；八是体外pre-DC和BMDC培养体系验证TGFβ和TGM对DC发育的直接效应。所有小鼠均为实验室饲养的C57BL/6品系，OT-II TCR转基因小鼠用于T细胞功能实验。

四、研究结果

（一）Hpb感染期间肠道DC区室发生改变**

利用优化的细胞分离方案，研究人员对Hpb感染0-14天内的SI LP DC进行了动态分析。结果显示，CD103?DC2的比例在7DPI开始增加，9DPI达到峰值后恢复至初始水平。在7DPI时间点，Hpb感染小鼠中CD103?DC2比例显著增加，CD103?DC2和DC1的绝对数量也显著上升。表型分析表明，CD103?DC2在感染后CD40?、CD83?、CD301b?、PD-L1?和PD-L2?细胞比例增加，IRF4和MAR-1表达水平升高，而CD80、CD101和TREM-1表达降低，呈现促炎性和Th2极化特征。相反，CD103?DC2中CD301b?、PD-L1?和PD-L2?细胞比例增加，但CD40、CD83、IRF4和MAR-1表达未改变，CD80?、CD86?和TREM-1?细胞比例降低，CD101维持高表达，呈现调节性表型。sMLN中迁移性DC的表型变化模式与SI LP基本一致。

（二）Hpb感染期间DC2亚群的功能分化**

FACS分选DC亚群后与OVA脉冲和OT-II CD4?T细胞共培养，结果显示感染来源的CD103?DC2和DC1驱动T细胞增殖的能力显著增强。CD103?DC2在感染后诱导IL-6、IL-10、IL-13、IL-17A和IFNγ产生的能力增强，而CD103?DC2在这些细胞因子诱导方面无显著变化。CD103?DC2在感染后保持甚至增强了驱动Foxp3?Treg分化的能力。ALDEFLUOR?实验显示，Hpb感染显著增加了两个DC2亚群的RA产生能力，而DC1的ALDH活性无显著变化。这些结果表明，Hpb感染导致两个DC2亚群在功能上发生显著分化：CD103?DC2呈现促炎性Th2驱动表型，而CD103?DC2维持调节性和Treg驱动能力。

（三）DC表型的空间异质性与Hpb肉芽肿的关系**

研究人员建立了从单个肉芽肿及其邻近组织分离细胞的方法。结果显示，肉芽肿邻近组织中CD103?DC2比例显著降低，而CD103?DC2和DC1在肉芽肿区域优先扩增。免疫荧光成像和CYCLOPS分析证实CD11b?CD103?和CD11b?CD103?细胞在肉芽肿周围聚集。表型分析显示，CD40?、CD83?、CD301b?、PD-L1?和PD-L2?细胞比例的升高在肉芽肿邻近的CD103?DC2中最为显著，而CD103?DC2即使靠近肉芽肿也未获得同等程度的促炎表型。

（四）肉芽肿邻近DC2亚群的转录谱差异

bulk RNA测序分析显示，DC2的转录谱根据亚群、感染状态和与肉芽肿的邻近程度清晰聚类。肉芽肿邻近的CD103?DC2富集了与早期DC发育（Irf8）和染色体凝集相关的基因，下调了与迁移、抗原加工递呈（Cd81、Cd44）相关的基因，呈现未成熟表型。肉芽肿邻近的CD103?DC2则富集了缺氧诱导基因（Egln3）、干扰素诱导蛋白（Ifi206）和与细胞因子信号传导、炎症反应和细胞迁移相关的生物学过程，呈现活化、促炎和迁移准备状态。针对Th2相关DC转录特征的靶向筛查显示，肉芽肿邻近的CD103?DC2富集了最多的Th2相关差异表达基因。TGFβ应答基因（GO:0071560）分析揭示了两个DC2亚群对TGFβ信号的差异应答模式：CD103?DC2在肉芽肿邻近上调了TGFβ信号终止和负反馈调节基因（Ppm1a、Pdcd5、Zeb2、Dab2），而CD103?DC2的TGFβ应答基因模式在感染期间保持稳定。

（五）体内抑制TGFβ信号增强抗蠕虫免疫应答

流式细胞术证实，纯化的TGM可结合SI LP中所有DC亚群，其中CD103?DC2和DC1的结合能力显著更高。在Hpb感染期间（3DPI和5DPI）腹腔注射SB431542抑制TGFβ信号后，sMLN中迁移性CD103?DC2数量显著减少。SB431542处理还导致SI LP中CD103?DC2的CD301b?细胞比例和两个DC2亚群的PD-L2?细胞比例增加，sMLN中PD-L2?DC2比例也增加。T细胞分析显示，SB431542处理显著增加了sMLN中GATA3?Th2细胞的比例和数量。寄生虫学指标方面，SB431542处理显著降低了粪便虫卵数和每虫产卵量（繁殖力），而抗TGFβ抗体处理未产生显著效应。抗原再刺激实验显示，SB431542处理组细胞在CD3刺激下产生显著更多的IL-13，而IFNγ产生显著减少。

（六）TGFβ信号将DC发育导向未成熟和调节性表型

体外实验中，FACS纯化的pre-DC在TGFβ或TGM存在下分化后，CD80、CD86、MHCII和IRF4表达降低，IRF8表达升高，呈现未成熟表型。这些细胞刺激抗原特异性CD4?T细胞增殖和活化的能力显著降低，但驱动Foxp3?Treg分化的能力增强。BMDC实验重复了上述发现，TGFβ或TGM处理的BMDC显示MHCII、IRF4、CD80表达降低，IRF8和CD103表达升高，刺激T细胞增殖和活化的能力下降。值得注意的是，TGFβ处理的BMDC能驱动更多Foxp3表达，而TGM处理的BMDC未显示此效应。

五、讨论与结论

本研究的讨论部分指出，抗蠕虫免疫应答主要由CD103?DC2亚群驱动，该亚群在Hpb感染中获得Th2驱动表型并在肉芽肿邻近区域表现最为显著。相反，CD103?DC2在感染期间保持未成熟和调节性特征，仍是Treg分化的优势诱导者。两个DC2亚群的功能分化与肉芽肿邻近程度相关，提示Hpb本身或其肉芽肿微环境是决定DC2表型和功能异质性的信号来源。TGFβ信号通路被鉴定为关键机制：Hpb通过产生TGM劫持内源性TGFβ信号通路，将DC2发育导向未成熟、调节性表型，从而削弱初始抗蠕虫Th2应答，为蠕虫在肠壁中的成熟和最终逸出提供保护。体内TGFβ抑制实验证实了这一机制的功能重要性，且pan-TGFβ抑制（SB431542）的效果显著强于仅中和内源性TGFβ的抗体处理，表明Hpb来源的TGM是TGFβ信号的主要来源。

研究结论：Hpb感染导致肠道DC2亚群在丰度、表型和功能上发生显著且动态的变化。CD103?DC2驱动保护性Th2应答，而CD103?DC2维持免疫调节功能。Hpb通过产生TGFβ模拟分子激活TGFβ信号通路，将DC发育导向未成熟和调节性表型，从而抑制宿主抗蠕虫免疫应答。体内阻断TGFβ信号可增强Th2应答并降低Hpb繁殖力。该研究首次揭示病原体可通过劫持TGFβ信号通路重塑DC发育来调节宿主免疫应答的机制，为理解蠕虫免疫逃逸策略和开发抗蠕虫免疫干预策略提供了新的理论基础。