FOCAD缺失在癌症中很常见，并赋予超依赖……

《Cancer Discovery》：FOCAD deletion is frequent in cancer and confers hyperdepe...

　　

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摘要

当肿瘤抑制基因通过染色体缺失失活时，相邻基因的缺失可能产生治疗性脆弱性。MTAP常与chr9p21肿瘤抑制基因CDKN2A共同缺失，从而对蛋白精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）产生合成致死依赖性。位于MTAP端粒侧的是focadhesin（FOCAD），其缺失会诱导对HBS1样翻译GTPase（HBS1L）–蛋白pelota同源物（PELO）核糖体救援复合物产生翻译维持依赖性。FOCAD在约1/3的MTAP缺失癌症中被删除。我们对一种免疫调节性恶唑类药物（IMiD）焦点多样性化合物库进行了筛选，鉴定出一个弱活性化合物，该化合物结合cereblon（CRBN），促进HBS1L–CRBN–化合物三元复合物形成，并诱导E3连接酶依赖的HBS1L泛素化降解。在冷冻电镜结构和蛋白质组选择性分析的指导下，我们开发了TNG961，一种强效、高选择性的HBS1L降解剂，可破坏HBS1L–PELO复合物，诱导翻译停滞、未折叠蛋白反应激活以及在FOCAD阴性模型中的生长抑制。口服给予TNG961可使FOCAD阴性异种移植瘤消退，包括PRMT5抑制剂难治性模型，从而确立HBS1L降解作为利用FOCAD缺失的策略，并支持TNG961作为一类首创精准肿瘤治疗药物的临床评估。意义：FOCAD缺失常与MTAP/CDKN2A缺失共同发生，从而对HBS1L–PELO核糖体救援复合物产生合成致死依赖性。TNG961是一种首创HBS1L分子胶降解剂，可强制翻译停滞并驱动FOCAD阴性模型中的肿瘤消退，包括PRMT5抑制剂难治性肿瘤，为染色体9p21共缺失背景确立了一种新颖的精准肿瘤治疗策略。

引言

肿瘤抑制基因的缺失往往导致邻近基因的附带性丧失，从而产生特异性的癌症依赖性（1）。此类"乘客"缺失可能并非肿瘤起始所必需，但在肿瘤进展过程中被保留，从而为合成致死治疗策略创造了机会。一个突出的例子是染色体9p21上MTAP与肿瘤抑制基因CDKN2A的共同缺失。在所有人类癌症中，MTAP与CDKN2A共缺失的比例为10%至15%，而MTAP的失活创造了对甲硫氨酸回收途径和蛋白精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）的合成致死依赖性（参考文献2–8），从而推动了PRMT5和MAT2A抑制剂在MTAP缺失肿瘤治疗中的临床开发（9–17）。位于MTAP端粒侧的是focadhesin（FOCAD），该基因作为同一9p21染色体缺失事件的一部分，在约三分之一的MTAP缺失癌症中被共同删除。FOCAD缺失广泛存在于多种肿瘤类型中，包括未满足医疗需求较高的癌症，如非小细胞肺癌（NSCLC）和胰腺癌（补充图S1A）。FOCAD基因编码FOCAD蛋白，其在维持mRNA质量控制中发挥关键作用，通过稳定SKI复合物实现（18, 19）。SKI复合物与RNA外切体协同，介导异常mRNA种类的降解，这些异常mRNA否则会停滞核糖体并破坏翻译稳态（20–23）。因此，FOCAD缺失使SKI复合物不稳定，导致缺陷转录本积累，并增加对下游核糖体救援途径的依赖性以维持蛋白质合成（24, 25）。多项独立的遗传学研究表明，FOCAD缺失创造了对HBS1样翻译GTPase（HBS1L）–蛋白pelota同源物（PELO）复合物的选择性依赖性，该复合物参与停滞核糖体的救援。在缺乏SKI复合物活性的情况下，这一核糖体救援途径成为维持翻译稳态所必需的，使得FOCAD阴性细胞对HBS1L或PELO的失活极为敏感。尽管这一合成致死相互作用十分有力，但利用该脆弱性的小分子策略尚未见报道。靶向蛋白降解已成为一种强大的方法，通过劫持泛素-蛋白酶体系统来针对难以成药的蛋白。特别是，分子胶降解剂通过稳定E3泛素连接酶与 neo 底物之间新的蛋白-蛋白相互作用来发挥作用，从而导致靶蛋白的选择性泛素化和降解。基于cereblon（CRBN）的分子胶已在临床上取得成功，但实现 neo 底物选择性，尤其是对于密切相关的蛋白质之间，仍是一个核心挑战（26）。鉴于HBS1L（也称为GSPT3）与相关翻译终止因子及常见免疫调节性恶唑类药物（IMiD）基降解剂 neo 底物GSPT1之间的高度同源性，通过分子胶降解剂模式靶向HBS1L颇具吸引力，但鉴定HBS1L的选择性降解剂对该模式而言是一项严格的考验。在此，我们报道了TNG961（27）的发现与临床前表征，它是一种首创的分子胶降解剂，选择性靶向HBS1L进行CRBN依赖的降解。通过双重重筛选策略（细胞水平与生化水平），并结合冷冻电镜分析指导的药物化学优化，我们开发了TNG961，一种强效、高选择性的降解剂，能够区分HBS1L与密切相关蛋白GSPT1。TNG961介导的HBS1L降解使HBS1L–PELO核糖体救援复合物不稳定，引发翻译停滞、未折叠蛋白反应（UPR）激活以及在FOCAD阴性细胞中的活力丧失，同时不影响FOCAD阳性细胞。在大规模体外谱分析中，FOCAD缺失表现为敏感性的主要生物标志物，这与SKI复合物功能障碍驱动的合成致死相互作用一致。在体内，口服给予TNG961可在多个来源不同组织学的FOCAD阴性异种移植瘤模型中诱导肿瘤消退，并在PRMT5抑制剂治疗进展的肿瘤中保持活性。综上，这些发现确立了HBS1L降解作为一种机制上独特且由生物标志物定义的、利用染色体9p21共缺失的治疗策略，并支持TNG961作为精准肿瘤治疗的临床开发，该治疗与现有MTAP靶向方法具有潜在的互补性。

结果

FOCAD缺失在癌症中的基因组背景与功能影响

肿瘤抑制基因的体细胞缺失经常扩展至驱动基因位点之外。利用cBioPortal对TCGA数据集进行泛癌分析显示，约三分之一的MTAP缺失癌症同时存在FOCAD缺失（图1A；参考文献5, 6, 28）。几乎所有FOCAD缺失都与MTAP和CDKN2A两者的缺失共同发生，后者是驱动共缺失现象的肿瘤抑制基因。总体而言，FOCAD改变存在于约6%的所有癌症病例中，以深度缺失为主（24）。这包括约6%的NSCLC病例，突显了一个具有高度未满足医疗需求的庞大患者群体。图1. 放大查看 下载幻灯片 FOCAD缺失在癌症中频繁发生，并赋予对HBS1L–PELO复合物的过度依赖性。A, 染色体9p上与CDKN2A邻近基因的MTAP共缺失频率。B, 全基因组CRISPR筛选中sgRNA水平的效应，筛选在FOCAD同基因MIAPACA2细胞中进行。表达FOCAD cDNA的细胞（FOCAD阳性）或空载体对照细胞（FOCAD阴性）被全基因组sgRNA文库感染，培养14天后提取基因组DNA并进行下一代测序。数据以FOCAD阴性细胞相对于FOCAD阳性细胞的log2倍变化（log2FC）显示。原始CRISPR筛选数据先前已报道（24）。C, FOCAD失活与HBS1L–PELO复合物之间合成致死相互作用背后治疗假设的模型。[部分使用BioRender创建，Nicholson, H E. (2023) https://BioRender.com/ralcu3s] 图1. 放大查看 下载幻灯片 FOCAD缺失在癌症中频繁发生，并赋予对HBS1L–PELO复合物的过度依赖性。A, 染色体9p上与CDKN2A邻近基因的MTAP共缺失频率。B, 全基因组CRISPR筛选中sgRNA水平的效应，筛选在FOCAD同基因MIAPACA2细胞中进行。表达FOCAD cDNA的细胞（FOCAD阳性）或空载体对照细胞（FOCAD阴性）被全基因组sgRNA文库感染，培养14天后提取基因组DNA并进行下一代测序。数据以FOCAD阴性细胞相对于FOCAD阳性细胞的log2倍变化（log2FC）显示。原始CRISPR筛选数据先前已报道（24）。C, FOCAD失活与HBS1L–PELO复合物之间合成致死相互作用背后治疗假设的模型。[部分使用BioRender创建，Nicholson, H E. (2023) https://BioRender.com/ralcu3s] 关闭 图1. 基于功能基因组学研究（DepMap分析；参考文献19, 24, 25）和内部CRISPR筛选（24），我们和其他人已经证明，FOCAD的失活导致对HBS1L-PELO核糖体救援复合物产生显著依赖性。HBS1L是一种翻译GTPase，与其结合伙伴PELO共同作用，解决停滞在非终止或非通行mRNA上的核糖体，从而防止翻译崩溃。这种依赖性在利用FOCAD同基因细胞进行的全基因组CRISPR筛选中明显可见（24），其中四个独立靶向HBS1L或PELO的sgRNA在FOCAD阴性细胞中相对于FOCAD阳性细胞表现出强效的缺失效应（图1B）。值得注意的是，HBS1L敲除在FOCAD阳性和FOCAD阴性条件之间表现出最大的差异，表明选择性药理学靶向HBS1L可能比PELO敲除时观察到的更为倾斜的泛致死效应提供更优的治疗窗口（24）。在机制上，FOCAD编码Focadhesion（FOCAD），一种稳定SKI复合物的蛋白（18, 19），该复合物与外切体共同降解异常mRNA，这些异常mRNA否则会停滞核糖体并破坏翻译维持（20–23）。因此，FOCAD缺失破坏了SKI复合物功能，促进缺陷转录本积累，并使细胞对HBS1L-PELO介导的核糖体救援产生过度依赖。图1C展示了这一治疗假设：在FOCAD阳性细胞中，FOCAD稳定的SKI复合物促进缺陷mRNA的降解并限制对核糖体救援的依赖，而在FOCAD阴性细胞中，SKI复合物功能的丧失导致核糖体在异常mRNA上的滞留，并对HBS1L-PELO复合物产生关键的翻译维持依赖性。因此，在SKI复合物破坏的背景下，HBS1L-PELO的失活具有选择性致死性，为在FOCAD缺失癌症中靶向HBS1L提供了令人信服的治疗依据。

平行细胞与生化筛选鉴定选择性HBS1L分子胶

我们实施了一种双重筛选策略，以鉴定既能诱导HiBiT基于的细胞靶蛋白降解，又能在生化检测中促进与CRBN形成三元复合物的化合物（图2A）。由于HBS1L是一个先驱性分子胶靶标，当时没有商用的HBS1L-HiBiT敲入细胞系，我们通过CRISPR将HiBiT标签工程化到Promega LgBiT HEK细胞的内源HBS1L基因座中，建立了内源HBS1L降解的高通量报告系统，而非过表达构建体。为从一开始就强制实现选择性，我们生成了N端和C端标记的HBS1L敲入细胞系，并将其与商用的293T GSPT1-HiBiT敲入细胞系配对作为反靶标反向筛选。同时，我们在时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）三元复合物检测中筛选了我们专有的分子胶化合物库，该检测测量化合物诱导的CRBN与HBS1L或GSPT1之间的接近。图2. 放大查看 下载幻灯片 活性发现策略及发现驱动CRBN依赖三元复合物形成和选择性HBS1L降解（相对于GSPT1）的分子胶。A, 用于鉴定HBS1L分子胶的平行筛选策略示意图。左，HiBiT基于的细胞检测，通过在HBS1L内源基因座CRISPR敲入HiBiT，实现靶蛋白降解的高通量测量。右，TR-FRET三元复合物检测，用于检测配体诱导的CRBN与HBS1L之间的接近。在两个检测中均有活性的化合物被优先推进。[部分使用BioRender创建，Teng, T. (2026) https://BioRender.com/14wx5zd; Teng, T. (2026) https://BioRender.com/3lkesgf] B, 初始筛选活性化合物TNG-6266和优化后TNG961的结构与活性总结，包括细胞降解和三元复合物形成检测。当Bmax < 50%时不报告AC50；DC50和AC50值已校正培养基结合。C, 化合物在HBS1L-HiBiT降解检测和HBS1L三元复合物形成（诱导接近）检测中的谱分析。颜色表示对HBS1L相对于GSPT1的选择性程度，DC50值已校正培养基结合。D, TNG-4857、TNG-7535和TNG-7326的活性总结；DC50和AC50值已校正培养基结合。E, TNG-4857（黄色）在HBS1L（绿色）与CRBN（蓝色）界面的结合，基于HBS1L–CRBN–DDB1复合物2.6 ?分辨率冷冻电镜结构（PDB 11MR）。虚线表示氢键。图2. 放大查看 下载幻灯片 活性发现策略及发现驱动CRBN依赖三元复合物形成和选择性HBS1L降解（相对于GSPT1）的分子胶。A, 用于鉴定HBS1L分子胶的平行筛选策略示意图。左，HiBiT基于的细胞检测，通过在HBS1L内源基因座CRISPR敲入HiBiT，实现靶蛋白降解的高通量测量。右，TR-FRET三元复合物检测，用于检测配体诱导的CRBN与HBS1L之间的接近。在两个检测中均有活性的化合物被优先推进。[部分使用BioRender创建，Teng, T. (2026) https://BioRender.com/14wx5zd; Teng, T. (2026) https://BioRender.com/3lkesgf] B, 初始筛选活性化合物TNG-6266和优化后TNG961的结构与活性总结，包括细胞降解和三元复合物形成检测。当Bmax < 50%时不报告AC50；DC50和AC50值已校正培养基结合。C, 化合物在HBS1L-HiBiT降解检测和HBS1L三元复合物形成（诱导接近）检测中的谱分析。颜色表示对HBS1L相对于GSPT1的选择性程度，DC50值已校正培养基结合。

D，TNG-4857、TNG-7535和TNG-7326的活性摘要；DC50和AC50值已针对培养基结合进行了校正。E，TNG-4857（黄色）在2.6 ?分辨率的冷冻电镜结构中与HBS1L（绿色）和CRBN（蓝色）界面处的结合，该结构为HBS1L–CRBN–DDB1复合物（PDB 11MR）。虚线表示氢键。关闭图2。HiBiT细胞筛选表现出良好的稳健性（Z′值>0.63），复孔板之间具有高度相关性（r2 = 0.662–0.891）。CC-885和CC-90009均作为GSPT1-HiBiT降解的阳性对照，而只有CC-885降解了HBS1L-HiBiT。应用>20%靶蛋白降解且<20%存活率影响的筛选标准，HBS1L和GSPT1的命中率分别为6.5%和19%。在平行筛选中，三元复合物形成测定同样具有稳健性（平均Z′ = 0.61–0.72；DMSO变异系数（CV）= 2.2–3.6%）。同样，只有CC-885诱导了CRBN与GSPT1和HBS1L之间的接近。以超过基线3个CV的信号为标准进行选择，HBS1L和GSPT1的命中率分别为0.58%和1.52%，单点后续测定中的再确认率超过70%。在此次筛选中，TNG-6266作为初始命中物脱颖而出，具有细胞内HBS1L降解（Dmax = 10 μmol/L时43%）和三元复合物形成（Bmax = 17%；图2B）的证据。值得注意的是，TNG-6266对GSPT1的降解不可测（DC50 > 10 μmol/L；Dmax = 11%）。这些数据表明，HBS1L的选择性降解是可以实现的，并为最终开发候选物TNG961（图2B）提供了令人鼓舞的起点。

**药物化学**

药物化学工作主要受筛选测定（HBS1L和GSPT1的HiBiT降解和三元复合物形成；图2C）的指导，同时参考了NCIH1755 FOCAD同源细胞系对中的7天细胞活力测定。进行了进一步的基于配体的设计，将该系列推进到代表性化合物TNG-4857（图2D）。在确定了TNG-4857驱动HBS1L与CRBN/DNA损伤结合蛋白（DDB1）之间三元复合物形成的2.6 ?分辨率冷冻电镜结构之后（图2E），探索了多种方法，包括邻位氟苯甲酰胺环化形成6,6-双环环的类似物，如TNG-7535和TNG-7326（图2D）。有趣的是，尽管TNG-7535在HBS1L降解和细胞活力测定中比TNG-4857更具活性（DC50 = 1 vs. 12 nmol/L；AC50 = 240 vs. 737 nmol/L），但它也意外地诱导了GSPT1降解（DC50 = 7 nmol/L）。相比之下，含萘环的类似物TNG-7326进一步提高了HBS1L三元复合物的活性（AC50 = 4 nmol/L；与TNG-7535相比提高了184倍），同时保持了选择性，未检测到GSPT1的降解（DC50 > 10 μmol/L；图2D）。萘环系列化合物的持续改进最终产生了TNG961，该化合物基于其体外和体内临床前特征被提名作为临床开发候选物。

**TNG961快速降解HBS1L而不影响GSPT1**

在细胞筛选测定中，TNG961处理导致HBS1L几乎完全降解（Dmax = 98%；24小时时DC50 = 7 nmol/L），同时不影响GSPT1-HiBiT水平，确认了对HBS1L相对于密切相关的GSPT1蛋白的选择性（图3A）。为探究TNG961的降解动力学，在活细胞测定中使用了HBS1L和GSPT1 HiBiT基因敲入细胞系。在TNG961处理后，在非裂解条件下每30分钟测量一次HiBiT信号。与裂解终点HiBiT测定的结果一致，TNG961以剂量依赖方式诱导HBS1L降解（图3B），而GSPT1-HiBiT未显示出可比的调控（补充图S1B）。在最高测试浓度下，HBS1L的最大降解在约4小时内达到，并在12小时测定期间持续维持抑制状态，这支持TNG961作为HBS1L快速、强效且选择性的降解剂。

图3. TNG961介导HBS1L–CRBN复合物形成，导致HBS1L降解和FOCAD依赖性存活率丧失。A，在293T HBS1L-HiBiT和293T GSPT1-HiBiT基因敲入细胞系中，用指定浓度的TNG961处理24小时后，通过HiBiT信号测量HBS1L和GSPT1的细胞内降解。数据为均值±标准差（N = 2个生物学重复；每个重复2个技术重复）。B，在293T HBS1L-HiBiT基因敲入细胞中，用指定浓度的TNG961处理后12小时内HBS1L的活细胞降解动力学，通过HiBiT信号测量。数据为均值±标准差（N = 2个生物学重复）。C，在递增浓度的TNG961存在下，CUL4A–RBX1–DDB1–CRBN与Avi标记的HBS1L（红色圆圈）或Avi标记的GSPT1（蓝色方块）之间的TR-FRET三元复合物形成。信号（%）以CC-885阳性对照孔为基准进行归一化。数据为均值±标准差（N = 3次独立实验；每次实验2个技术重复）。D，TNG961存在下HBS1L（绿色）与CRBN–DDB1复合物（蓝色和粉色）结合的冷冻电镜结构（2.9 ?）（PDB 10AY）。E，TNG961（橙色）在CRBN–HBS1L界面处的近距离表面视图（PDB 10AY）。显示了HBS1L的表面，虚线表示氢键。F，CC-885（紫色）在CRBN–GSPT1界面处的近距离表面视图（PDB 5HXB）。显示了GSPT1的表面。关闭图3。

**TNG961选择性驱动CRBN–HBS1L三元复合物形成和泛素化**

利用TR-FRET三元复合物形成测定，TNG961以剂量依赖方式选择性促进了Cullin 4A（CUL4A）–RING-box蛋白1（RBX1）–DDB1–CRBN与HBS1L之间的三元复合物形成（AC50值为14.7 nmol/L），而GSPT1的AC50值>10 μmol/L（图3C）。相比之下，非特异性GSPT1分子胶降解剂CC-885（29–31）与GSPT1和HBS1L均形成了三元复合物（补充图S1C）。值得注意的是，TNG961实现的HBS1L三元复合物形成的最大水平（Bmax）高于CC-885，提示其具有增强的复合物形成倾向和/或更大的复合物稳定性。这些结果强调了TNG961诱导HBS1L与功能性CRBN E3连接酶复合物接近关联的能力，且对GSPT1具有高选择性。为进一步评估选择性，我们开发了一种使用纯化的泛素化机制蛋白（E1、E2和E3复合物；参考文献32、33）与HBS1L或GSPT1的体外泛素化测定。在这些条件下，CC-885和TNG961均促进了HBS1L的ATP依赖性多聚泛素化（补充图S1D）。分子胶降解剂分子的存在对于两种蛋白均可检测到的多聚泛素化至关重要。相比之下，TNG961未诱导GSPT1的多聚泛素化（补充图S1E），进一步支持了选择性CRBN–HBS1L复合物形成的结论。

**HBS1L募集和GSPT1选择性的结构基础**

为定义驱动TNG961活性的分子相互作用，我们解析了全长DDB1与CRBN（氨基酸40–442）和HBS1L（氨基酸478–684）在TNG961存在下结合的冷冻电镜结构（图3D）。2.9 ?分辨率的结构显示，TNG961的谷氨酰胺-萘基团位于CRBN中已知被其他CRBN靶向分子胶的谷氨酰胺基团占据的疏水口袋中（31、34）。HBS1L的降解环位于这一经典口袋的一侧。TNG961的脲基团与来自HBS1L和CRBN的残基形成氢键，而三氟甲基-苯并噻吩基团则位于由来自HBS1L和CRBN的残基所组成的疏水口袋中（图3E）。HBS1L残基Arg664的胍基团以阳离子-π堆积排列横跨苯并噻吩环的平面。最后，TNG961的偕二甲基基团位于HBS1L的一个β折叠片旁边，并与之形成范德华相互作用。与报道的CC-885与GSPT1–CRBN–DDB1复合物结合的晶体结构比较（图3F；参考文献31）表明，CC-885和TNG961占据CRBN结合口袋中重叠的区域。与CC-885已知的非选择性特征一致，其结合模式与GSPT1和HBS1L的募集均兼容。相比之下，GSPT1相对于HBS1L的表面拓扑结构差异似乎与TNG961的容纳不兼容，导致预测的空间位阻冲突，这与其实验观察到的选择性特征一致。这些结构观察为TNG961的选择性提供了事后解释。

**TNG961诱导CRBN依赖性内源性HBS1L降解并具有蛋白质组范围内的选择性**

与HiBiT测定结果一致（图3A），TNG961在代表多个谱系的四种癌细胞系中（NCIH838、MIAPACA2、NCIH1755和RS411）诱导了内源性HBS1L的强效降解，如Western blot所示（图4A）。HBS1L结合伙伴PELO的去稳定化也被观察到，这与先前遗传学证据表明HBS1L依赖性PELO稳定性一致（24）。CRBN敲除完全挽救了TNG961介导的HBS1L降解（图4B；补充图S1F），而与neddylation抑制剂MLN4924（TAK924，pevonedistat；参考文献35、36）联合处理则部分恢复了HBS1L蛋白水平至DMSO的约50%，证实了对Cullin依赖性E3连接酶泛素化的需求（图4C）。

图4. TNG961诱导强效、选择性的CRBN依赖性HBS1L降解。A，用TNG961处理24小时后，在指定细胞系中通过Western blot测量的内源性HBS1L降解和PELO去稳定化。最高剂量为10 μmol/L，以9点、3倍稀释系列测试。代表性图像来自N = 2个生物学重复。B，在亲本和CRBN敲除（sgCRBN）MIAPACA2细胞中，用指定浓度的TNG961处理24小时后通过Western blot评估HBS1L降解和PELO去稳定化的CRBN依赖性。代表性图像来自N = 2个生物学重复。C，在MIAPACA2细胞中，单独用TNG961或联合100 nmol/L MLN4924处理24小时后通过Western blot评估neddylation依赖性。代表性图像来自N = 2个生物学重复。D，在亲本MIAPACA2细胞以及表达HBS1L G625N（覆盖内源性HBS1L敲除）或GSPT1 G575N（覆盖内源性GSPT1敲除）的构建细胞系中，用指定浓度的TNG961处理24小时后通过Western blot评估降解环依赖性。代表性图像来自N = 3个生物学重复。E，MM.1s细胞经500 nmol/L TNG961或DMSO处理6小时后的全局定量蛋白质组学。数据以相对蛋白丰度（TNG961/DMSO）显示；标注了HBS1L、PELO和常见IMiD新底物。F，用指定浓度的TNG961处理24小时后对常见CRBN新底物的Western blot分析。代表性图像来自N = 2个生物学重复。关闭图4。

代表性图片来自 N = 3 个生物学重复。E，MM.1s 细胞用 500 nmol/L TNG961 或 DMSO 处理 6 小时后的全局定量蛋白质组学分析。数据以相对蛋白丰度（TNG961/DMSO）表示；HBS1L、PELO 及常见的 IMiD 新底物已标注。F，用不同浓度 TNG961 处理 24 小时后的常见 CRBN 新底物的免疫印迹分析。代表性图片来自 N = 2 个生物学重复。关闭图 4。CRBN 通过保守的降解环与某些新底物相互作用，以 GSPT1 中 G575N 突变为例，该突变可消除分子胶降解剂 MRT-2359 诱导的 CRBN 依赖性降解（31, 37）（补充图 S1G）。类似地，在 HBS1L 降解环中引入相应的甘氨酸突变（G625N）完全消除了 TNG961 诱导的 HBS1L 降解（图 4D），进一步证实了 HBS1L 通过 CRBN 的直接识别。为评估蛋白质组水平的选择性，我们在 MM.1s 细胞中进行了全局定量蛋白质组学研究，因为该细胞系表达了大多数常见的 IMiD 靶向新底物。用 TNG961 处理 6 小时后，HBS1L 是最显著改变的蛋白（图 4E；补充数据集 S1）。没有其他蛋白达到预设的显著性标准（丰度变化≥50%；P < 0.01；>1 个独特肽段；序列覆盖率≥10%）或在 24 小时后得到重现。用 TNG961 处理 24 小时后，PELO 显著耗竭，与 HBS1L 作为直接靶点一致，而 PELO 的不稳定是 HBS1L 耗竭的次要后果（补充图 S2A）。如果采用较宽松的 P 值标准（P < 0.05），NUBPL 是 24 小时后唯一被鉴定为相对丰度显著变化的其他蛋白（补充图 S2B，补充数据集 S1），但基于蛋白质-蛋白质相互作用网络分析（STRING-db.org），它与 HBS1L-PELO 之间没有已知或预测的功能联系。转录因子 SALL4 是一种与 IMiD 相关致畸性有关的 CRBN 新底物（31, 38），在 MM.1s 细胞中不表达。因此，我们在 Kelly 细胞系中评估了 TNG961 处理对 SALL4 的影响（补充图 S2C）。尽管沙利度胺、泊马度胺和来那度胺处理后 SALL4 蛋白水平下降，但所有测试剂量的 TNG961 均未影响其水平。其他已确立的 CRBN 新底物（GSPT1、GSPT2、CK1α、Ikaros、Aiolos 和 Helios）也进行了类似分析，在 TNG961 处理后未显示显著降解（图 4F），支持蛋白质组水平的选择性。TNG961 在体外选择性抑制 FOCAD 阴性细胞生长，并在体内导致肿瘤消退

为评估 TNG961 处理对细胞活力的影响，我们构建了 FOCAD 状态不同的同基因型细胞系配对。在缺乏内源性 FOCAD 的非小细胞肺癌细胞系 NCIH1755 中，全长 cDNA 的重新表达使 FOCAD 蛋白水平恢复至与内源性细胞系相当的水平（补充图 S3A）。TNG961 以 100 nmol/L 的效力抑制 FOCAD 阴性 NCIH1755 细胞的活力，而 FOCAD 重建细胞在高达 10 μmol/L 的浓度下未受影响（图 5A）。这种 100 倍的选择性窗口在多个 FOCAD 同基因型配对中得以重现，涉及多种谱系，包括重新表达 FOCAD cDNA 的 FOCAD 阴性细胞系（NCIH1775、MIAPACA2、MDAMB231）以及通过敲除 FOCAD 生成的 FOCAD 阳性细胞系（HeLa、HAP1）（图 5B；补充图 S3B–S3E）。FOCAD 阴性细胞与 FOCAD 阳性细胞生长抑制之间的宽选择性窗口表明 TNG961 具有较大的治疗指数潜力。图 5。放大查看 下载幻灯片 TNG961 在体外选择性抑制 FOCAD 阴性细胞的活力，并在体内抑制 FOCAD 阴性肿瘤的生长。A，FOCAD 同基因型 NCIH1755 细胞用不同浓度 TNG961 处理 7 天后的相对活力，通过 CellTiter-Glo 测定。数据为均值±SD（N = 3 个生物学重复）。B，不同亲本模型的 FOCAD 同基因型细胞系配对用 TNG961 处理 7 天后的相对活力，通过 CellTiter-Glo 测定。HAP1 和 HeLa 是内源性 FOCAD 阳性，同基因型配对通过 FOCAD 敲除生成；NCIH1755、MIAPACA2 和 MDA-MB-231 是内源性 FOCAD 阴性，同基因型配对通过全长 FOCAD cDNA 重新表达生成。选择性计算为 FOCAD 阳性细胞中的效力除以 FOCAD 阴性细胞中的效力。数据为均值±SD（N = 3 个生物学重复）。C，TNG961 在一系列内源性 FOCAD 阴性和 FOCAD 阳性细胞系中的效力，处理 7 天后测定（最高浓度 3 μmol/L），通过 CellTiter-Glo（活力检测）测定并调整为游离效力以考虑血清蛋白结合（在不同培养条件下为 5%–20%）。游离效力高于最高测试浓度的细胞系绘制在最高剂量处。数据为均值±SD（每个模型 N = 2 个技术重复）。D，MIAPACA2 异种移植瘤荷瘤小鼠连续 7 天每日两次给药后 TNG961 的血浆暴露量及相应的肿瘤药效学，通过最后一次给药后 12 小时免疫印迹分析评估（HBS1L 蛋白水平以载体对照条带强度的比例表示）。E–H，来自不同模型的异种移植瘤荷瘤小鼠（每组 N = 8 只）口服不同剂量 TNG961、每日两次、给药一定时间后的肿瘤体积随时间的变化。数据为均值±SEM。图 5。放大查看 下载幻灯片 TNG961 在体外选择性抑制 FOCAD 阴性细胞的活力，并在体内抑制 FOCAD 阴性肿瘤的生长。A，FOCAD 同基因型 NCIH1755 细胞用不同浓度 TNG961 处理 7 天后的相对活力，通过 CellTiter-Glo 测定。数据为均值±SD（N = 3 个生物学重复）。B，不同亲本模型的 FOCAD 同基因型细胞系配对用 TNG961 处理 7 天后的相对活力，通过 CellTiter-Glo 测定。HAP1 和 HeLa 是内源性 FOCAD 阳性，同基因型配对通过 FOCAD 敲除生成；NCIH1755、MIAPACA2 和 MDA-MB-231 是内源性 FOCAD 阴性，同基因型配对通过全长 FOCAD cDNA 重新表达生成。选择性计算为 FOCAD 阳性细胞中的效力除以 FOCAD 阴性细胞中的效力。数据为均值±SD（N = 3 个生物学重复）。C，TNG961 在一系列内源性 FOCAD 阴性和 FOCAD 阳性细胞系中的效力，处理 7 天后测定（最高浓度 3 μmol/L），通过 CellTiter-Glo（活力检测）测定并调整为游离效力以考虑血清蛋白结合（在不同培养条件下为 5%–20%）。游离效力高于最高测试浓度的细胞系绘制在最高剂量处。数据为均值±SD（每个模型 N = 2 个技术重复）。D，MIAPACA2 异种移植瘤荷瘤小鼠连续 7 天每日两次给药后 TNG961 的血浆暴露量及相应的肿瘤药效学，通过最后一次给药后 12 小时免疫印迹分析评估（HBS1L 蛋白水平以载体对照条带强度的比例表示）。E–H，来自不同模型的异种移植瘤荷瘤小鼠（每组 N = 8 只）口服不同剂量 TNG961、每日两次、给药一定时间后的肿瘤体积随时间的变化。数据为均值±SEM。关闭图 5。FOCAD 缺失是大规模分析中的主要生物标志物

为进一步评估 FOCAD 状态作为敏感性决定因素的作用，我们使用 7 天 CellTiter-Glo 检测对一组包含所有可获得 FOCAD 阴性模型和大致匹配的 FOCAD 阳性、组织学匹配对照的 >90 个亲本细胞系进行了分析（图 5C）。TNG961 仅在 FOCAD 阴性细胞系中表现出强效力，大多数 FOCAD 阳性细胞系在最高测试剂量下无反应。游离效力值≤10 nmol/L 的细胞系涵盖了广泛的谱系，支持 FOCAD 缺失作为敏感性主要遗传驱动因素而非谱系特异性依赖性。为进一步在大规模层面确认脱靶活性和基因组背景，我们与 PRISM 实验室（MIT 和哈佛 Broad 研究所）合作进行了 5 天多重活力筛选。在 >900 个细胞系中，TNG961 的敏感性谱与 HBS1L 和 PELO 基因敲除特征相关性最强（补充图 S4A）。这些数据与我们的体外验证实验和全局蛋白质组学研究一致，后者确定 HBS1L 是 TNG961 处理后最显著改变的蛋白。与 TNG961 敏感性最密切相关的基因表达特征包括 FOCAD 和 KLHL9，后者是位于 MTAP 和 FOCAD 之间的另一 9p21 染色体基因（图 1A），也经常与 FOCAD 共同缺失（补充图 S4B）。综合这些发现，支持了 FOCAD 依赖性在更广泛的 9p21 染色体共缺失背景中的作用。口服 TNG961 产生与暴露量相关的 HBS1L 降解和肿瘤消退

为将这些发现转化为体内应用，我们在 MIAPACA2 异种移植瘤中进行了药代动力学和药效学研究。口服给药 TNG961 产生大致与剂量成比例的血浆暴露量（图 5D），连续 7 天每日两次给药后，收集的肿瘤进行免疫印迹分析显示与血浆暴露量和分子胶降解剂模式一致的剂量依赖性 HBS1L 降解（图 5D）。接下来，我们评估了肿瘤 HBS1L 降解是否能转化为抗肿瘤活性。移植 FOCAD 阴性细胞的小鼠口服 TNG961，每日两次，监测肿瘤生长。在 MIAPACA2 衍生的异种移植瘤中，治疗导致剂量依赖性肿瘤生长抑制，6 mg/kg 时 8 只小鼠中有 3 只完全消退，20 mg/kg 时 8 只小鼠中有 7 只完全消退（图 5E）。根据体重测量推断，所有剂量的 TNG961 均耐受良好（补充图 S4C）。在另外三个 FOCAD 阴性模型中重现了剂量依赖性肿瘤生长抑制：非小细胞肺癌细胞系 NCIH838（图 5F）、血液癌细胞系 RS411（图 5G）和非小细胞肺癌细胞系 NCIH1755（图 5H）。所有模型对 TNG961 治疗均有反应，具有显著的肿瘤生长抑制和良好的耐受性（补充图 S4D–S4F）。总之，这些结果表明 TNG961 在多种 FOCAD 阴性肿瘤类型中具有稳健的体内疗效，支持对 FOCAD 缺失癌症的组织学无关开发策略。TNG961 在 FOCAD 阴性而非 FOCAD 阳性细胞中诱导翻译抑制和内质网应激及未折叠蛋白反应

我们的数据表明，TNG961 介导的 HBS1L 降解在体外和体内选择性抑制 FOCAD 阴性细胞的生长。为阐明其机制，我们询问 TNG961 介导的 HBS1L 降解是否以 FOCAD 依赖的方式诱导翻译抑制，这与我们的治疗假说一致（图 1C）。使用嘌呤霉素掺入实验推断活性翻译，我们观察到 TNG961 显著减少了嘌呤霉素在 FOCAD 阴性 MIAPACA2 细胞中的掺入，但在 FOCAD 重建细胞中则没有（图 6A，补充图 S5A）。这种翻译变化不太可能是活力下降的结果，因为嘌呤霉素掺入减少先于活力缺陷约 5 天。数据支持一种模型，即在没有 FOCAD 的情况下，HBS1L-PELO 复合物的活性对于翻译稳态是必需的。图 6。放大查看 下载幻灯片 TNG961 在 FOCAD 缺失细胞中选择性诱导翻译抑制并激活内质网应激和 UPR。A，FOCAD 同基因型 MIAPACA2 细胞用不同浓度 TNG961 处理 48 小时后通过嘌呤霉素掺入评估的翻译情况。嘌呤霉素免疫印迹强度以 Ponceau 染色归一化以控制蛋白上样量。柱状图显示均值±SD（N = 3 个生物学重复）。**，P < 0.01，双因素 ANOVA 加 Sidak 多重比较检验（与 DMSO 比较）。代表性印迹图见补充图 S5A。B，FOCAD 同基因型 MIAPACA2 细胞用不同浓度 TNG961 处理 48 小时后通过 Simple Western 评估的 HBS1L、IFRD1 和 vinculin 蛋白水平。代表性图片来自 N = 2 个生物学重复。C，FOCAD 同基因型 MIAPACA2 细胞用不同浓度 TNG961 处理 48 小时后通过免疫印迹评估的 ATF4 和 vinculin 蛋白水平。Tm，曲尼霉素（ATF4 诱导的阳性对照）。代表性图片来自 N = 2 个生物学重复。D，在表达多西环素（DOX）诱导型 FOCAD cDNA 的 MIAPACA2 细胞（-DOX，FOCAD 不表达/FOCAD 缺失；+DOX，FOCAD 表达/FOCAD 重建）中用不同浓度 TNG961 处理 72 小时后通过免疫印迹评估的剪接 XBP1（XBP1s）和肌动蛋白水平。代表性图片来自 N = 2 个生物学重复。E，FOCAD 同基因型 MIAPACA2 细胞用不同浓度 TNG961 处理 48 小时后通过 qPCR 分析的 CHOP、TRIB3 和 GADD34 mRNA 水平。柱状图显示均值±SD（N = 4 个生物学重复）。*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001；****，P < 0.0001，单因素 ANOVA 加 Dunnett 多重比较检验（与 DMSO 比较）。

ANOVA P 值（FOCAD 缺失）：CHOP P = 0.0044，TRIB3 P < 0.0001，GADD34 P = 0.0016；ANOVA P 值（FOCAD 回补）：CHOP P = 0.4290，TRIB3 P = 0.0320，GADD34 P = 0.0108。

图 6. 放大显示 下载幻灯片

TNG961 在 FOCAD 缺失细胞中选择性诱导翻译停滞并激活内质网应激和 UPR。A，FOCAD 同源 MIAPACA2 细胞经不同浓度 TNG961 处理 48 小时，通过丙氨酸残基（丙氨酸丙氨酸丙氨酸丙氨酸丙氨酸丙氨酸丙氨酸丙氨酸丙氨酸丙氨酸丙氨酸）掺入评估翻译。丙氨酸残基免疫印迹强度经普伦苏（普伦苏）染色归一化以控制蛋白装载量。柱形图表示平均值 ± 标准差（N = 3 个生物学重复）。**，与 DMSO 相比，双向 ANOVA 配合 Sidak 多重比较检验 P < 0.01。补充图 S5A 显示代表性印迹。B，FOCAD 同源 MIAPACA2 细胞经不同浓度 TNG961 处理 48 小时后，通过 Simple Western 检测 HBS1L、IFRD1 和 vinculin 蛋白水平。代表性图像来自 N = 2 个生物学重复。C，FOCAD 同源 MIAPACA2 细胞经不同浓度 TNG961 处理 48 小时后，通过 Western blot 检测 ATF4 和 vinculin 蛋白水平。Tm，紫杉醇（紫杉醇；ATF4 诱导的阳性对照）。代表性图像来自 N = 2 个生物学重复。D，表达多西环素（DOX）诱导型 FOCAD cDNA 的 MIAPACA2 细胞（?DOX，FOCAD 未表达/FOCAD 缺失；+DOX，FOCAD 表达/FOCAD 回补），经不同浓度 TNG961 处理 72 小时后，通过 Western blot 检测剪接 XBP1（XBP1s）和 actin 蛋白水平。代表性图像来自 N = 2 个生物学重复。E，FOCAD 同源 MIAPACA2 细胞经不同浓度 TNG961 处理 48 小时后，通过 qPCR 分析 CHOP、TRIB3 和 GADD34 mRNA 水平。柱形图表示平均值 ± 标准差（N = 4 个生物学重复）。*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001；****，P < 0.0001，采用 Dunnett 多重比较检验的单因素 ANOVA（与 DMSO 相比）。ANOVA P 值（FOCAD 缺失）：CHOP P = 0.0044，TRIB3 P < 0.0001，GADD34 P = 0.0016；ANOVA P 值（FOCAD 回补）：CHOP P = 0.4290，TRIB3 P = 0.0320，GADD34 P = 0.0108。

图 6. 核糖体可在非终止或无通过 mRNA 转录本上与部分翻译蛋白停滞，并依赖于 HBS1L–PELO 复合物进行救援（39–41）。在缺乏 HBS1L-PELO 活性的情况下，部分翻译蛋白的积累可触发内质网（ER）应激和 UPR 的激活（19, 24, 25, 42, 43）。我们假设，由于 SKI 复合物失稳和异常 mRNA 的持续表达，这种效应会在缺乏 FOCAD 的细胞中不成比例地被放大。与此模型一致，TNG961 处理在 FOCAD 阴性 MIAPACA2 细胞中选择性导致 ER 应激标记物 IFRD1 上调，而在同源的 FOCAD 回补细胞中没有诱导（图 6B）。在 FOCAD 敲除的 HeLa 细胞中观察到类似结果（对 TNG961 处理产生 IFRD1 上调），但在 FOCAD 内源完整的野生型 HeLa 细胞中未观察到（补充图 S5B）。同样，我们利用来自 6 天药代动力学/药效学（PK/PD）研究的样本评估了 MIAPACA2 异种移植肿瘤中的应激通路激活情况。qPCR 显示，与载体相比，TNG961 处理肿瘤中 IFRD1 mRNA 显著诱导，这与我们在体外的应激反应发现一致。除 IFRD1 激活外，我们还寻求了支持 ER 应激和 UPR 诱导的正交证据。ATF4 的翻译可与 IFRD1 并行激活，是 ER 应激反应的典型特征（18, 43）。与 UPR 激活一致，TNG961 在 FOCAD 阴性 MIAPACA2 和 HeLa 细胞中诱导 ATF4 蛋白表达，但在其 FOCAD 阳性对应物中未观察到（图 6C；补充图 S5D）。ER 应激的另一标志是 XBP1 转录因子的剪接（44）。在 UPR 期间，未剪接的 XBP1 异构体被加工以产生一种替代的活性异构体（XBP1s）。与我们先前的发现一致，TNG961 增加了 FOCAD 阴性 MIAPACA2 细胞中的 XBP1s 水平，但在 FOCAD 回补细胞中未诱导 XBP1 剪接（图 6D）。由于 ER 应激信号传导可驱动与活力丧失相关的下游转录程序，我们接下来评估了 MIAPACA2 和 HeLa FOCAD 同源对的 UPR 相关基因诱导。每条细胞系对都用 TNG961 处理，并通过 qPCR 检测 CHOP、TRIB3 和 GADD34 的 mRNA 水平（图 6E；MIAPACA2；补充图 S5E；HeLa）。与 IFRD1 和 ATF4 蛋白水平的变化一致，我们观察到 FOCAD 阴性细胞系中 CHOP、TRIB3 和 GADD34 出现约 5 至 10 倍的上调，但在 FOCAD 阳性细胞系中未观察到类似影响。这些发现与已发表的结果相符，即 HBS1L 基因敲除在 FOCAD 同源细胞中引发类似的转录反应（24）。综合而言，这些数据支持一个模型，即 TNG961 诱导的 HBS1L 降解在 FOCAD 阴性细胞中选择性触发翻译停滞、ER 应激和 UPR 激活，从而导致活力受损。

TNG961 在 PRMT5 抑制剂治疗进展的异种移植肿瘤中诱导消退

上述研究证明，TNG961 在 FOCAD 阴性肿瘤中具有强劲的单一疗法活性。鉴于甲基硫腺苷（MTA）协同的 PRMT5 抑制剂具有临床前景，且由于 CDKN2A 顺带缺失导致的 FOCAD 缺失常伴随 MTAP 共同缺失，我们提出：在 MTAP/FOCAD 共同缺失的、对 PRMT5 抑制剂治疗产生进展的肿瘤中，TNG961 是否能提供互补活性。为验证这一点，对荷有 MIAPACA2 异种移植瘤的小鼠分别给予 TNG961 或 MTA 协同 PRMT5 抑制剂 vopimetostat（TNG462；图 7A；文献 9）治疗。TNG961（60 mg/kg）迅速达到完全肿瘤反应，8 只小鼠中 8 只在 15 天内均无可测量肿瘤。相比之下，vopimetostat 起初抑制肿瘤生长，但约 2 周后肿瘤继续进展，这与既往使用另一种 MTA 协同 PRMT5 抑制剂治疗 MIAPACA2 肿瘤的报告一致（45, 46）。在先前的研究中，我们确定在 vopimetostat 治疗期间进展的 MIAPACA2 肿瘤（此处定义为自第 9 天观察到的最大反应后肿瘤增长 > 200%）仍保持 MTAP 缺失并表现出 PRMT5 抑制，表明 vopimetostat 在进展时仍然具有药理学活性（补充图 S6A–S6C）。为确定在 PRMT5 抑制剂治疗期间进展的肿瘤是否仍对 HBS1L 降解敏感，一个 vopimetostat 治疗组在第 21 天观察到肿瘤生长证据后改为 TNG961 治疗（图 7A，黑色箭头）。该组所有肿瘤在化合物转换后迅速消退，证明 PRMT5 抑制剂与 TNG961 具有互补活性及不重叠的耐药机制。所有处理均良好耐受，体重维持即为证（补充图 S6D）。

图 7. 放大显示 下载幻灯片

TNG961 在 PRMT5 抑制剂耐药情况下显示体内活性，并抑制携带 FOCAD C 末端截断的细胞生长。A，荷有 MIAPACA2 异种移植瘤的小鼠每日口服两次给予 60 mg/kg vopimetostat（TNG462）或 60 mg/kg TNG961。21 天后（黑色箭头），按指示继续治疗（蓝色和灰色）或从 vopimetostat 转为 TNG961（红色）。使用卡尺测量肿瘤体积（每组 N = 8 只小鼠）。数据为平均值 ± 标准误。B，示意图显示 9p21 染色体上 FOCAD 与 CDKN2A 的尾对尾取向。C，MDA-MB-231、DAOY 和 NCIH838 细胞中内源性 FOCAD 截断的映射，使用跨越 FOCAD 位点的探针进行 qPCR。黑色区段表示已确认表达的编码区，灰色区段表示阳性探针（黑色）与第一个阴性探针（横条末端）之间的编码区。D，NCIH1755 细胞被工程化表达 HA 标记的 FOCAD cDNA，编码所示 C 末端截断。通过 CellTiter-Glo 评估 TNG961 处理 7 天后的相对活力。数据为平均值 ± 标准差（N = 2 个生物学重复）。E，Western blot 确认 HA 标记 FOCAD 截断的表达及对应作用于 SKIV2L 稳定性的效果。代表性图像来自 N = 2 个生物学重复。

图 7. 放大显示 下载幻灯片

TNG961 在 PRMT5 抑制剂耐药情况下显示体内活性，并抑制携带 FOCAD C 末端截断的细胞生长。A，荷有 MIAPACA2 异种移植瘤的小鼠每日口服两次给予 60 mg/kg vopimetostat（TNG462）或 60 mg/kg TNG961。21 天后（黑色箭头），按指示继续治疗（蓝色和灰色）或从 vopimetostat 转为 TNG961（红色）。使用卡尺测量肿瘤体积（每组 N = 8 只小鼠）。数据为平均值 ± 标准误。B，示意图显示 9p21 染色体上 FOCAD 与 CDKN2A 的尾对尾取向。C，MDA-MB-231、DAOY 和 NCIH838 细胞中内源性 FOCAD 截断的映射，使用跨越 FOCAD 位点的探针进行 qPCR。黑色区段表示已确认表达的编码区，灰色区段表示阳性探针（黑色）与第一个阴性探针（横条末端）之间的编码区。D，NCIH1755 细胞被工程化表达 HA 标记的 FOCAD cDNA，编码所示 C 末端截断。通过 CellTiter-Glo 评估 TNG961 处理 7 天后的相对活力。数据为平均值 ± 标准差（N = 2 个生物学重复）。E，Western blot 确认 HA 标记 FOCAD 截断的表达及对应作用于 SKIV2L 稳定性的效果。代表性图像来自 N = 2 个生物学重复。

图 7. FOCAD C 末端截断表型模拟 FOCAD 缺失并赋予 TNG961 敏感性

FOCAD 基因在 chr9p21 上以尾对尾方式与 CDKN2A 取向（图 7B），因此自 CDKN2A 延伸的染色体缺失可从 3' 端截断 FOCAD。利用跨越 FOCAD 位点铺设的 qPCR 探针，我们鉴定出多个具有内源性 FOCAD 3' 截断的细胞系（图 7C）。在外显子 20 后被截断的 MDA-MB-231 细胞（图 5B）和 NCIH838 异种移植瘤（图 5F）对 TNG961 敏感，表明其相对于 SKI 复合物稳定化的 FOCAD 功能丧失以及由此产生的 HBS1L 合成致死。我们随后询问较小的 3' 截断是否同样能表型模拟完全 FOCAD 缺失，若是，则确定使 FOCAD 失活所需的最小截断。利用内源缺失整个 FOCAD 基因的 NCIH1755 细胞，我们表达了一系列 C 末端截断的 FOCAD 构建体，分别缺少 1 至 20 个氨基酸，并通过 7 天活力测定作为 FOCAD 功能的替代指标评估 TNG961 敏感性（图 7D）。全长 FOCAD（无截断）和空载体对照（无 FOCAD 表达）分别作为最大挽救和最大敏感性对照。一个外显子的截断表型模拟完全 FOCAD 缺失。虽然 1 个或 5 个氨基酸的截断保留与全长 FOCAD 相当的耐药性，10 个氨基酸的截断表现出中间表型，但 15 个氨基酸的截断表型模拟完全 FOCAD 缺失并赋予完全的 TNG961 敏感性。因此，移除少至 15 个 C 末端残基即足以就 HBS1L 合成致死而言使 FOCAD 失活。与我们所提出的 FOCAD 稳定化 SKI 复合物（图 1C）模型一致，赋予 TNG961 敏感性的 FOCAD 截断（15 个氨基酸、20 个氨基酸或 1 个外显子）同样未能通过 Western blot 评估稳定化 SKI 复合物组分 SKIV2L（图 7E），而较短的截断则保留 SKIV2L 稳定性。综合而言，这些数据支持一个模型，即 FOCAD 的 C 末端对于稳定化 SKI 复合物是必需的，并表明即使携带 FOCAD 小截断的肿瘤也可能对 TNG961 治疗产生应答。

讨论

生物标志物驱动的临床开发已多次改变肿瘤学实践。早期成功如 ERBB2 扩增乳腺癌中的 HER2 靶向治疗帮助建立了获批的开发范式，随后扩展至多种基因型定义的情境，包括 EGFR、BRAF、ALK、KRAS 和 NTRK 驱动的癌症（47）。与此同时，合成致死策略的临床成功，特别是 PARP 抑制剂在 BRCA1/2 突变肿瘤中的应用，验证了一个更广泛的原则，即抑癌基因缺失可定义可操作的治疗漏洞（47）。在此背景下，9p21 染色体缺失是人类癌症中最常见的基因组事件之一，由抑癌基因 CDKN2A 的缺失所致，并常扩展至附近基因如 MTAP 和 FOCAD 的顺带共缺失（图 1A）。在治疗策略上，9p21 染色体缺失背景已经推动了利用 MTAP 缺失的合成致死策略开发，包括 MTA 协同 PRMT5 抑制剂（如 vopimetostat、navlimetostat）和 MAT2A 抑制剂的临床努力。本研究描述了 TNG961，一种口服、强效且高选择性的 HBS1L 分子胶降解剂，旨在利用 9p21 染色体同源缺失所造成的额外脆弱性。在不同组织学中，约三分之一的 MTAP 缺失癌症中出现 FOCAD 缺失（补充图 S1A），凸显了广泛的治疗机会。FOCAD 缺失与 HBS1L–PELO 核糖体救援复合物之间的合成致死关系最初通过 CRISPR 基于功能基因组学筛选鉴定（图 1B），并最近被多个研究组独立验证（19, 24, 25）。

TNG961是一种新型分子胶降解剂，也是首个利用HBS1L-FOCAD合成致死性的药物，通过整合生物化学和基于细胞的表型筛选（图2A–C）以及后续的药物化学工作（图2D和E）发现。在机制上，TNG961使HBS1L和CRBN相互靠近，促进三元复合物的形成，从而促进HBS1L的泛素化，随后实现目标降解（图3A–C；补充图S1B–S1E）。冷冻电镜结构证实TNG961促进了CRBN-HBS1L三元复合物的形成（图3D和E），该复合物在体外和细胞中均能进行泛素化，最终导致HBS1L在不同细胞系中降解（图4A）。与该机制一致，TNG961诱导的HBS1L降解及其引起的PELO不稳定均依赖于CRBN和 neddylation（图4B和C；补充图S1F）。此外，HBS1L降解环中保守甘氨酸残基的突变（HBS1L G625N）可完全挽救TNG961诱导的HBS1L降解（图4D），这与靶向GSPT1的分子胶降解剂MRT-2359中类似的G575N突变（补充图S1G）通过消除CRBN依赖性降解（31, 37）的情况一致。临床上批准的基于CRBN的降解剂如沙利度胺、来那度胺和泊马度胺均具有已知的致畸性风险，这些风险与招募和降解特定新底物（包括SALL4（48））有关。相比之下，TNG961对HBS1L表现出蛋白质组水平的选择性，对其他已建立的新底物没有显著影响（图4E和F；补充图S2A–S2C），PELO的降低与HBS1L结合伴侣丧失所导致的继发性不稳定效应一致。我们通过免疫印迹观察到TNG961处理后CK1α呈剂量依赖性增加（图4F），但在全蛋白质组学中未能重现（图4E；补充图S2A和S2B）。这种差异的原因尚不清楚，有待进一步研究，但这并不改变我们的总体结论，即TNG961对HBS1L具有高选择性。在功能上，TNG961选择性导致FOCAD阴性模型丧失活力，但对FOCAD阳性模型无此效果，在FOCAD等基因细胞系对中的选择性约为100倍（图5A和B；补充图S3），且在大范围癌症细胞系图谱中对FOCAD阳性细胞影响极小（图5C）。PRISM筛选>900条细胞系进一步证实了9号染色体9p21缺失背景（补充图S4A和S4B）。其他导致SKI复合物失活的遗传改变，如微卫星驱动的不稳定使SKI复合物成员四螺旋重复域37（TTC37）失稳，也被预测依赖HBS1L-PELO功能，这凸显了该相互作用的可重复性并支持了所提出的机制（19, 25）。尽管SKI复合物失活的替代机制在我们的PRISM筛选中未评分，但这可能与其在细胞系中低表示或注释有关。在体内，TNG961表现出剂量比例的药代动力学和药效动力学，HBS1L降解与暴露量相关（图5D）。在跨不同组织学的额外FOCAD阴性异种移植模型中观察到显著的剂量依赖性肿瘤生长抑制和消退（图5E–H；补充图S4C–S4F），支持FOCAD状态而非肿瘤谱系是TNG961敏感性的主要驱动因素。在机制上，HBS1L降解在FOCAD阴性细胞中（但在FOCAD重组细胞中不）引发翻译停滞（图6A；补充图S5A）。翻译停滞及停滞核糖体导致的不完整蛋白积累可触发经典内质网应激标志物的诱导和内质网应激/未折叠蛋白反应（UPR）的激活，包括IFRD1的诱导、ATF4、XBP1剪接以及已充分描述的下游转录反应（18, 19, 24, 25, 39–44）。我们在体外选择性观察到这些经典内质网应激和UPR通路标志物在FOCAD阴性背景下的激活（图6B–E；补充图S5B–S5E），并在肿瘤异种移植模型中观察到IFRD1的额外诱导（补充图S5C）。由于9p21上FOCAD的功能丧失始终与MTAP/CDKN2A缺失共存（图1A），我们的发现促使人们评估与PRMT5或MAT2A抑制剂的联合策略。MTA协同的PRMT5抑制剂在MTAP缺失的肿瘤类型中具有临床活性（13, 49）；然而，患者的最大获益可能通过联合治疗实现。在临床前，MIAPACA2 FOCAD/MTAP双阴性PDAC异种移植模型对MTA协同的PRMT5抑制剂耐药（50, 51），但TNG961可诱导对vopimetostat进展的肿瘤消退（图7A；补充图S6），支持这些方式之间敏感性和耐药机制的非重叠性。综合来看，这些数据表明TNG961可能在更广泛的chr9p21共缺失人群中占据一个独特的临床定位，且与MTA协同的PRMT5或MAT2A抑制剂的联合或序贯治疗可能通过互补的作用机制加深和/或延长疗效。尽管临床前数据支持TNG961在FOCAD缺失癌症中的单药治疗（不受组织学影响），但此处描述的机制（核糖体救援中断导致翻译停滞和内质网应激/UPR激活）提示，肿瘤特异性联合选定的细胞毒性或靶向治疗骨干方案可能因其差异化作用机制而具有吸引力。然而在临床上，标准治疗（SOC）因组织学和线序而异，使得跨组织学的联合策略难以标准化。因此，我们认为TNG961最好在FOCAD缺失的肿瘤中以组织学无关的方式进行单药治疗推进。一旦确认单药活性，临床开发路径将采用以下两条路径之一：(i) 继续进行组织学无关的单药治疗扩展和/或 (ii) 在肿瘤特异性队列（如NSCLC）中进行重点开发，在早期线评估一组小规模的预设标准治疗骨干方案，因为这些方案中治疗药物更为明确。这种单药优先的策略得到了FOCAD缺失广泛分布（补充图S1A）以及FOCAD状态而非谱系驱动TNG961敏感性在体外和体内模型中的支持（图5）。在FOCAD阴性患者选择方面，我们表明FOCAD的功能丧失（无论是完全缺失还是小的C端截断）均使细胞对TNG961敏感（图7B–D），并使SKI复合物组分SKIV2L不稳定（图7E），从而在FOCAD缺失的遗传背景与分子靶点HBS1L之间建立了机制性联系。值得注意的是，仅约15至20个C端残基的截断即可在功能上模拟FOCAD蛋白完全丧失（图7D）。这一观察对前瞻性患者选择检测设计具有实际意义，包括抗体表位的选择以减少假阴性分类，以及对具有外显子水平断点分辨率的DNA测序方法的解读。综合来看，本研究确立了TNG961为一种口服、强效且选择性的首创降解剂，靶向HBS1L/PELO核糖体救援复合物，验证了FOCAD缺失作为临床可行生物标志物的价值，并支持包括组织学无关、生物标志物定义的单药治疗及可行的分阶段适应症定制联合治疗在内的临床开发策略。

材料与方法

关键试剂（补充表S1）；细胞系和培养条件（补充表S2）；cDNA、sgRNA及其他DNA/RNA序列（补充表S3）；以及冷冻电镜数据采集、精修和验证统计（补充表S4）可在补充材料中获取。化学化合物

MG132购自Selleck Chemicals（S2619）。MLN4924购自MedChemExpress（HY-70062）。CC-885购自MedChemExpress（HY-101488）。TNG-6266购自Enamine（Z5000160111）。TNG961由药明康德合成（批号WX-TJ-HC-1120-01和WX-TJ-HC-1120-02；平均纯度99.1%）。蛋白表达与纯化

全长人HBS1L（用于生物化学实验）

表达构建体包含N端6×His标签、TEV蛋白酶切割位点和Avi标签（His-TEV-Avi-HBS1L），克隆至pFastBac1（Invitrogen 10359016）并在Sf9细胞中表达。通过在大肠细胞中共表达BirA与HBS1L实现体内生物素化。在27°C表达48小时后，收获细胞并悬浮于缓冲液A中[50 mmol/L Tris，pH 8.0；500 mmol/L NaCl，10%（v/v）甘油；1 mmol/L Tris（2-羧乙基）-磷酸-HCl（TCEP）]，并添加10 mmol/L咪唑、苯甲酰胺酶（125 U/mL细胞培养物）和蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche, 05056489001）。细胞通过超声破碎（3秒开/3秒关，200 W）。裂解物通过两次离心（20,300 × g，30分钟）澄清，上清液与5 mL预平衡的Ni-NTA树脂（QIAGEN, 30230）在4°C孵育1小时。树脂装入层析柱，洗涤，并以含梯度咪唑（20、50、250 mmol/L）的缓冲液A洗脱蛋白。将洗脱蛋白合并，与His标签TEV蛋白酶（1:2 w/w）在4°C过夜孵育。样品重新上样Ni-NTA以去除TEV蛋白酶和未消化的蛋白。流出物装入Strep-Tactin 4Flow柱（IBA Lifesciences, 2-1250-010），用缓冲液A平衡，洗涤，并以补充50 mmol/L生物素的缓冲液A洗脱。合并组分后进行浓缩，并通过尺寸排阻色谱（SEC）在Superdex 200 10/300柱（Cytiva, 28990944）上用SEC缓冲液（10 mmol/L HEPES，pH 7.0；240 mmol/L NaCl；3 mmol/L TCEP）进一步纯化。纯化的蛋白（3.3 mg/mL）分装后于-80°C保存。

截断人HBS1L（用于结构研究）

该构建体编码N端6×His标签麦芽糖结合蛋白（MBP），随后为TEV蛋白酶切割位点和HBS1L（478–684；His-MBP-TEV-HBS1L），通过杆状病毒在Hi-5昆虫细胞中表达，27°C培养48小时。裂解和通过TEV切割的纯化按照全长HBS1L所述的方法进行。第二次Ni-NTA步骤后，流出物上样Resource S柱（Cytiva, 17118001），用含250 mmol/L NaCl的缓冲液A平衡，通过线性梯度至1.0 mol/L NaCl洗脱蛋白。合并组分后浓缩，并通过尺寸排阻色谱在Superdex 75 10/300柱（GE HealthCare）上用终缓冲液（10 mmol/L HEPES，pH 8.0；240 mmol/L NaCl，3 mmol/L TCEP；5%甘油）纯化。纯化的蛋白（8.4 mg/mL）分装后于-80°C保存。

全长人GSPT1（用于生物化学实验）

该构建体克隆至pET21a并在大肠杆菌BL21-Gold(DE3)中表达。构建体包含N端6×His标签、SUMO标签和Avi标签（His-SUMO-Avi-GSPT1）。在OD600 = 0.6时，用0.2 mmol/L IPTG在16°C诱导表达12小时。收获细胞并悬浮于补充10 mmol/L咪唑、1 mmol/L苯甲磺酰氟（PMSF）和25 U/mL苯甲酰胺酶的缓冲液A中。细胞通过超声破碎裂解并通过离心（20,300 × g，30分钟）澄清。上清液与10 mL预平衡的Ni-NTA（QIAGEN, 30230）在4°C孵育1小时，洗涤，并以梯度咪唑（20、50、250 mmol/L）的缓冲液A洗脱。将洗脱蛋白合并，与Ulp1蛋白酶（1:100 w/w）在4°C过夜孵育，同时透析至50 mmol/L Tris，pH 8.0；75 mmol/L NaCl；7.5 mmol/L MgCl2；1 mmol/L TCEP中。消化的蛋白通过加入His-BirA（1:150 w/w）及0.5 mmol/L生物素和1 mmol/L ATP进行生物素化，在18°C孵育4小时。样品通过Ni-NTA以去除His-BirA和未消化的蛋白。流出物装入HiTrap Heparin HP柱（Cytiva, 17040601），以含50 mmol/L Tris，pH 8.0；10%甘油；1 mmol/L TCEP的缓冲液中从50 mmol/L至1.0 mol/L NaCl线性梯度洗脱。合并组分，浓缩，并通过Superdex 200 10/300柱在10 mmol/L HEPES，pH 7.0；240 mmol/L NaCl；3 mmol/L TCEP中进行SEC抛光。纯化的蛋白（4.9 mg/mL）分装后于-80°C保存。

CRBN-DDB1复合物

对于三元复合物形成实验，CUL4A-RBX1-DDB1-CRBN购自商业渠道（R&D Systems, E3-650或ChemPartner 202401264101）。对于冷冻电镜研究，CRBN（40–442）与全长DDB1在昆虫细胞中按照先前描述的方法生产，只是CRBN构建体中的凝血酶切割位点被TEV切割位点取代。初始Ni-NTA纯化按照全长HBS1L所述的方法进行；CRBN-DDB1在20和50 mmol/L咪唑组分中被洗脱。合并组分后与TEV蛋白酶（1:10 w/w）在4°C过夜孵育，并重新上样Ni-NTA以去除TEV蛋白酶和未消化的蛋白。CRBN-DDB1从流出物和20 mmol/L咪唑洗脱物中稀释至50 mmol/L NaCl并上样HiTrap Heparin HP柱（Cytiva, 17040601）；污染物结合树脂，CRBN-DDB1收集于流出物中。复合物通过Superdex 200 26/600柱（Cytiva, 28989336）在10 mmol/L HEPES，pH 7.0；240 mmol/L NaCl；3 mmol/L TCEP中进行SEC进一步纯化。纯化的蛋白浓缩至>16 mg/mL，分装后于-80°C保存。

冷冻电镜

复合物组装与载网制备

HBS1L-CRBN-DDB1 + TNG-4857和TNG961复合物在载网制备前通过共纯化组装。HBS1L（478–684）和CRBN（40–442）/DDB1以1:1（摩尔比）混合，在含3.3倍摩尔过量的胶合物的10 mmol/L HEPES，pH 7.0；250 mmol/L NaCl；3 mmol/L TCEP中，在4°C过夜孵育，并通过Superdex 200 10/300进行SEC纯化。

单峰SEC（分子排阻色谱）包含所有三种蛋白质，已通过SDS-PAGE确认。纯化后的复合物（8 mg/mL）与0.2%的正辛基葡萄糖苷混合后立即用于样品网格制备。样品被滴加到经辉光放电处理的UltrAuFoil金网格上（R1.2/1.3，300目；Electron Microscopy Sciences，Q350AR13A），吸滤2秒，然后在8°C、100%湿度的条件下，使用Vitrobot IV（Thermo Fisher Scientific，RRID:SCR_025773）在液态乙烷中进行玻璃化冻结。

**数据采集与处理**

数据在300 kV Titan Krios G4（Thermo Fisher Scientific）上采集，配备Falcon 4i探测器，运行于计数模式（Viva Biotech）。电影数据采集放大倍数为130,000×（像素尺寸0.932 ?），总剂量为48 e?/?2，分40帧采集。TNG-4857和TNG961分别采集了16,029和9,532帧电影，离焦范围为?1.0至?2.2 μm，使用Selectris X能量过滤器（20 eV狭缝宽度）。处理在RELION v5.0（RRID:SCR_016273）中进行，依次进行运动校正和对比度传递函数（CTF）估计，随后进行自动挑选和颗粒提取。对于TNG961，约4.5 mol/L的颗粒被带入2D分类、从头重构和3D分类。最佳分类中的898,000个颗粒经过额外的3D分类、CTF优化和3D优化，最终得到669,000个颗粒用于重构2.9 ?全局分辨率的图谱。对于TNG-4857，约10 mol/L的初始颗粒经过相同的流程优化，最终得到661,000个颗粒用于构建最终图谱。初始模型通过刚性对接CRBN/DDB1（PDB 5HXB）和HBS1L（未发表）生成，随后在Coot（RRID:SCR_014222）和Phenix（RRID:SCR_014224）中进行迭代优化。图形在PyMOL（Schr?dinger，RRID:SCR_000305）中生成。冷冻电镜数据采集、优化和验证统计数据见补充表S4。

**细胞系工程构建与细胞培养**

**细胞培养**

细胞在37°C、5% CO?的湿润培养箱中培养。每周使用MycoAlert（Lonza，LT07-318）进行支原体检测。细胞系通过短串联重复序列（STR）分析进行鉴定（LabCorp），传代次数不超过15代，且在冻存解冻后8周内使用。细胞系来源、培养条件、质粒插入序列和关键试剂列于补充表S1-S3。

**慢病毒转导**

为了构建稳定细胞系，将目的质粒和包装混合物（Cellecta，CPCP-K2A）与Lenti-X细胞（Takara Bio，632180）共转染过夜，使用Lipofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific，L3000015）在Opti-MEM（Gibco，31985-062）中进行。16至24小时后，更换为新鲜DMEM + 30% FBS培养基。转染后48小时收获病毒上清液，并过滤（0.45 μm）。靶细胞与含病毒培养基共孵育过夜，培养基中补充8 μg/mL多聚赖氨酸（Sigma-Aldrich，TR-1003）。细胞恢复培养24小时后，根据构建体的抗性卡式盒使用抗性药物筛选：Blasticidin（Gibco，A1113903）、Puromycin（Gibco，A1113803）或G418（Gibco，10-131-035）。

**HiBiT CRISPR敲入细胞系**

HBS1L-HiBiT细胞通过RNP介导的CRISPR编辑流程，将HiBiT敲入HEK293（LgBiT）细胞（Promega，N2672）的内源性HBS1L位点获得。从100 μmol/L Alt-R Cas9 crRNA和100 μmol/L Alt-R Cas9 tracrRNA在双链缓冲液中对配混合制备24 μmol/L tracrRNA:crRNA双链体，95°C加热5分钟，然后冷却至室温。加入TruCut Cas9（20 μmol/L），孵育10至20分钟形成RNP；电穿孔用的最终RNP浓度为4 μmol/L。细胞用无酶试剂（Sigma，C5914）消化，离心收集（90 × g，10分钟，室温），重悬于SF缓冲液中（Lonza，V4XC-2032）。每次电穿孔使用2 × 10?个细胞、4 μmol/L RNP、100 μmol/L供体模板（IDT）和100 μmol/L电穿孔增强剂（IDT，1075915），在25 μL体系中使用4D-Nucleofector X Unit（Lonza，AAF-1003X；RRID SCR_023155；程序CM-130；两次脉冲）进行。细胞在预温培养基（80 μL）中恢复，转移至6孔板，用青霉素-链霉素培养。为评估HiBiT表达，将1 × 10?个细胞/40 μL以三重复方式接种于白色384孔板中，同时接种HEK293 GSPT1-HiBiT阳性对照细胞（Promega，CS3023106）；仅培养基孔作为背景。平衡15分钟后，加入2×裂解试剂（Promega，N3040；将20 μL底物与1 mL裂解缓冲液混合配制），40 μL/孔，室温振荡20分钟。使用PHERAstar（RRID SCR_027001）或EnVision（RRID SCR_018038）酶标仪测量发光（PHERAstar：增益3600，积分时间0.1秒；EnVision：积分时间0.5秒）。从阳性池分离单细胞克隆，通过PCR和测序确认HiBiT的正确整合。

**HiBiT检测**

**终点（裂解）HiBiT检测**

细胞以每孔10,000个接种于384孔板，使用含10% FBS的DMEM培养基，贴壁过夜。然后加入化合物，孵育24小时，按照制造商说明使用Nano-Glo HiBiT裂解检测系统（Promega，N3040）检测HiBiT标记蛋白。使用EnVision酶标仪（Revvity，RRID SCR_018038）测量发光，积分时间0.1秒。

**活细胞动力学HiBiT检测**

细胞以每孔20,000个接种于384孔板，使用CO?非依赖性培养基（Invitrogen，18045088），补充1 mmol/L丙酮酸钠（Thermo Fisher Scientific，11360070）、2 mmol/L L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，25030081）和1×青霉素-链霉素（Thermo Fisher Scientific，15140163），贴壁过夜。次日，按照制造商说明加入Nano-Glo Endurazine Live Cell Substrate（Promega，N2570），孵育2小时。随后加入处理剂，立即使用PHERAstar酶标仪（BMG，RRID: SCR_027001）在指定时间间隔测量发光。

**TR-FRET三元复合物形成检测**

定量化合物诱导三元复合物形成的TR-FRET邻近检测在中国ChemPartner进行。将CC-885和TNG961分装（顶浓度10 μmol/L终浓度；10点3倍系列稀释）至PerkinElmer OptiPlate-384中，使用Echo550声学力分配器（Labcyte，RRID:SCR_027476）。在1×检测缓冲液（50 mmol/L HEPES，pH 8.0；50 mmol/L NaCl；5 mmol/L MgCl?；0.01% BSA；0.05% Tween-20；1 mmol/L TCEP）中组装反应，加入5 μL 2× His标签CUL4A-RBX1-DDB1-CRBN复合物（GSPT1反应用25 nmol/L或HBS1L反应用50 nmol/L；ChemPartner，20240126410），再加入5 μL 2× Avi标签蛋白（HBS1L 50 nmol/L或GSPT1 25 nmol/L；Viva ID如上述所列）。室温孵育1小时后，加入10 μL 2×检测混合物（0.67 nmol/L抗-6×His-Tb cryptate Gold，Revvity，61HI2TLB；83.33 nmol/L链霉亲和素-XL665，Revvity，610SAXLB）。96孔板离心（1,000 rpm，30秒），25°C孵育3小时。在EnVision酶标仪上读取TR-FRET（Revvity；激发340 nm；发射615/665 nm，RRID:SCR_018038）。信号计算为665/615比值，并使用%Activation = 100 × (Ratio ? Min)/(Max ? Min)转化为%激活率，其中Max定义为10 μmol/L CC-885，Min定义为仅DMSO孔。剂量-反应曲线在XL-Fit（模型205）中拟合以确定AC50值。Bmax表示相对于检测对照的最大三元复合物信号。

**活性筛选（平行筛选）**

通过定制合成和商业购买（Enamine）组装了专有CRBN聚焦分子胶化合物库，并配制为384孔板中10 mmol/L DMSO母液。小分子库包含约3,500个药物样化合物（平均分子量= 429 g/mol），包括CRBN靶向化合物（如琥珀酰亚胺）和其他E3靶向弹头（如DCAF15）。该库通过以下方式平行筛选：（i）在HBS1L-HiBiT和GSPT1-HiBiT工程化细胞中的HiBiT终点降解检测（10 μmol/L；24小时；终体积40 μL；1.25% DMSO）和（ii）TR-FRET三元复合物检测（筛选格式：1 μmol/L；1% DMSO；体积20 μL；HBS1L 25 nmol/L，GSPT1 12.5 nmol/L；0.33 nmol/L Mab抗-6HIS-Tb cryptate Gold和41.67 nmol/L链霉亲和素-XL665检测混合物）。孔板布局见（补充图S7A和S7B），CC-885和CC-90009作为GSPT1降解剂对照纳入细胞筛选；CC-885作为三元复合物筛选的阳性对照。细胞和三元复合物筛选均设置重复（N = 2），计算重复孔板间的统计表现和相关性（补充图S7C-S7E）。符合标准（降解率>20%且活力损失<20%）的化合物在单点和剂量-反应HiBiT检测中确认，并进一步通过蛋白酶体抑制剂（MG132）和NEDD8激活酶抑制剂（MLN4924，pevonedistat）敏感性进行验证。三元复合物筛选的活性化合物在单点和剂量-反应TR-FRET检测中确认。

**体外泛素化检测**

分子胶介导的泛素化反应（20 μL）含有25 nmol/L UBA1（South Bay Bio，SBB-CE0011）、25 nmol/L UBE2D1（South Bay Bio，SBB-CE0021）、20 nmol/L CUL4A-RBX1-DDB1-CRBN（ChemPartner，20240126410）、1 μmol/L泛素（LifeSensors，SI-0201-5000）、100 μmol/L ATP（Thermo Fisher Scientific，R0441）和20 nmol/L HBS1L或GSPT1（Viva，ID如上述所列），外加10 μmol/L CC-885（阳性对照）或TNG961，在检测缓冲液（ChemPartner）中进行。阴性对照省略ATP或目的蛋白。反应在25°C孵育3或24小时，用4×十二烷基肌氨酸钠（LDS）上样缓冲液淬灭。样品（每孔10 ng目的蛋白）在NuPAGE Novex 4%至12% Bis-Tris凝胶上电泳分离，转膜至0.2 μm硝酸纤维素膜（iBlot）。膜在Odyssey封闭缓冲液（LICORbio，927-50000）中封闭1小时，然后4°C孵育一抗过夜（抗泛素P4D1，CST，#3936；抗HBS1L，Proteintech，10359-1-AP；抗GSPT1，CST，14980S；均为1:1,000）。TBST洗涤（50 mmol/L Tris，pH 7.0；150 mmol/L NaCl；0.05% Tween-20）后，膜在室温下与LICOR二抗（抗小鼠926-68072或抗兔926-32213；1:10,000）孵育1小时，洗涤后在Odyssey系统上成像（扫描设置169 μm，中等质量，RRID:SCR_023227）。

**免疫印迹**

**Western Blot**

细胞用预冷1× PBS冲洗一次，直接用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Life Technologies，78445）的RIPA缓冲液（Life Technologies，89901）裂解。裂解物经20,000 × g离心10分钟澄清。使用BCA蛋白检测（Thermo Fisher Scientific，23227）或Pierce 660 nm蛋白检测（Thermo Fisher Scientific，22660）定量蛋白浓度。加入等体积含二硫苏糖醇（DTT；Thermo Fisher Scientific，B0008/B0009）的LDS上样缓冲液至裂解物中，95°C加热5至10分钟。蛋白在4%至12% Bis-Tris凝胶上电泳分离（Thermo Fisher Scientific，WG1402BOX；每孔20-40 μg），转膜至硝酸纤维素膜（Thermo Fisher Scientific，IB33002）。

**Simple Western（Jess）**

细胞沉淀在含蛋白酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific，1861281）和通用核酸酶（VWR，PI88701）的RIPA缓冲液（Thermo Fisher Scientific，89900）中裂解。裂解物经10,000 × g、4°C离心10分钟澄清，使用Pierce Rapid Gold BCA（Thermo Fisher Scientific，A53225）测定蛋白浓度。Simple Western分析在Jess（Bio-Techne，RRID:SCR_025095）上按制造商方案进行，使用Compass软件v6.2.0分析。抗体来源和稀释度见补充表S1。

**全局蛋白质组学**

细胞（MM.1s）按指示处理，沉淀闪冻后-80°C保存。冷冻沉淀在液氮下研磨，在含1% SDS和1%蛋白酶抑制剂（裂解物体积的4倍）中裂解，随后超声处理。裂解物经12,000 × g、4°C离心10分钟澄清，BCA法测定蛋白浓度。蛋白用丙酮沉淀（先混合1体积冷丙酮，再加入4体积冷丙酮；-20°C放置2小时），离心（4,500 × g，5分钟），用冷丙酮洗涤2至3次并干燥。沉淀在三乙胺碳酸氢盐（TEAB，终浓度200 mmol/L）中重悬，超声处理，用胰蛋白酶（1:50，w/w）过夜消化。样品用DTT（5 mmol/L；56°C，30分钟）还原，用碘乙酰胺（11 mmol/L；15分钟，避光，室温）烷基化。肽段用溶剂A（0.1%甲酸，2%乙腈溶于水）溶解，加载至反相分析柱（25 cm，100 μm内径）。肽段在NanoElute UHPLC（Bruker，RRID:SCR_026972）上用溶剂A和溶剂B（0.1%甲酸溶于乙腈）分离，流速450 nL/分钟，梯度为：0至70分钟，B相从6%至24%；70至84分钟，B相从24%至35%；84至87分钟，B相从35%至80%；87至90分钟，B相80%。数据在timsTOF Pro（RRID SCR_026544）上以dia-PASEF模式采集（全MS/MS扫描范围100-1,700；每个周期10次PASEF MS/MS扫描）。

细胞活力检测（CellTiter-Glo法）将细胞接种于96孔板中，使检测终点时达到约80%的汇合度，过夜贴壁后于次日进行处理。化合物处理7天后，按照制造商说明使用CellTiter-Glo（Promega, G9241）检测ATP水平作为细胞活力的替代指标。使用EnVision读板仪（Revvity, SCR_018038）测量发光信号。
异种移植研究
体内研究在中国康龙化成（Pharmaron）进行，遵循机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的方案以及国际实验动物评估与认证协会（AAALAC International）指南。将6至8周龄雌鼠在侧腹部皮下接种，具体方法如下：MIAPACA2，1×10?个细胞接种于BALB/c裸鼠（江苏集信生物科技）中，起始瘤体积约150至200 mm3时开始给药；NCIH838，1×10?个细胞接种于BALB/c裸鼠（JCYK）中，起始约150 mm3时开始给药；RS411，1×10?个细胞接种于NOD SCID小鼠（AKYB）中，起始约100至150 mm3时开始给药；NCIH1755，1×10?个细胞接种于NOD SCID小鼠（AKYB）中，起始约100至150 mm3时开始给药。TNG961的配方为10% DMSO/70% PEG400/20%水，Vopimetostat的配方为水中5% DMA/20% Captisol。使用游标卡尺每周测量肿瘤两次，体积按（长×宽×宽）/2计算。每日监测体重用于确定给药剂量，并每周记录两次。根据需要采集血液进行药代动力学分析，收集肿瘤进行药效动力学分析。
嘌呤霉素掺入实验
将细胞接种使检测结束时达到70%至80%的汇合度。处理后移除培养基，用PBS（Invitrogen, 10010001）洗涤细胞。在预热培养基中加入嘌呤霉素（20 μmol/L；货号见补充表S1），37°C孵育15分钟。用冰冷PBS洗涤细胞，直接在孔板中用冰冷的RIPA裂解缓冲液（Thermo Fisher Scientific, 89900，补充Halt蛋白酶/磷酸酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific, 78446）裂解细胞。等量蛋白在4%至12% Bis-Tris凝胶（Thermo Fisher Scientific, WG1403）上进行电泳分离，使用抗嘌呤霉素抗体（Sigma-Aldrich, MABE343）检测嘌呤霉素标记的新生肽段。嘌呤霉素信号以Ponceau染色（Thermo Fisher Scientific, A40000279）进行归一化。
qPCR
用DPBS洗涤细胞后，在补充RNasin（Promega, N2515；1:40）的RNA细胞裂解缓冲液（Boston Bioproducts, R-108）中裂解细胞。按照制造商说明使用TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix（Life Technologies, 4444436）及补充表S1中列出的探针进行检测。以RPLP0作为内参基因。通过与DMSO处理对照相比，使用ΔΔCt法计算mRNA相对水平。
数据分析（使用GraphPad PRISM、ImageJ及Spotfire进行可视化）
数据分析使用GraphPad Prism（GraphPad Software, RRID SCR_002798）和Spotfire（TIBCO Software, RRID SCR_008858）完成。常规Western印迹的灰度分析使用ImageJ（NIH, RRID SCR_003070）进行。
数据可用性
支持本研究结果的数据可向通讯作者索取。TNG-4857和TNG961与HBS1L–CRBN–DDB1复合物结合的结构的原子坐标已存入蛋白质数据银行（PDB），登录号分别为11MR和10AY。相关的冷冻电镜图谱可在电子显微镜数据库（EMDB）中获取，登录号为EMD-75840和EMD-75038。
作者利益冲突披露
H.E. Nicholson声明其受雇于Tango Therapeutics并持有Tango Therapeutics股票。D.A. Whittington声明在提交工作之外从Sesame Therapeutics获得个人费用，并受雇于Tango Therapeutics且持有Tango Therapeutics股票。F.J. Bruzzese声明其受雇于Tango Therapeutics并持有Tango Therapeutics股票。K. Lazarides声明其受雇于Tango Therapeutics并持有Tango Therapeutics股票。M.R. Tonini声明其受雇于Tango Therapeutics。H.N. Jenkins声明其受雇于Tango Therapeutics并持有Tango Therapeutics股票。P. Shahagadkar声明其受雇于Tango Therapeutics并持有Tango Therapeutics股票。K.J. Briggs声明其受雇于Tango Therapeutics并持有Tango Therapeutics股票。A.W. Tsai声明其受雇于Tango Therapeutics并持有Tango Therapeutics股份。C. Min声明在提交工作之外获得Tango Therapeutics的其他支持。A. Huang声明其持有Tango Therapeutics股份，且A. Huang是Tango Therapeutics的顾问。S.R. Meier声明其受雇于Tango Therapeutics并持有Tango Therapeutics股份。B. Shen声明其受雇于Tango Therapeutics并持有Tango Therapeutics股票。Y. Yu声明其受雇于Tango Therapeutics并持有Tango Therapeutics股票。C. Liang声明其有工艺和多晶型专利申请中，并受雇于Tango Therapeutics且持有Tango Therapeutics股票。Y. Liu声明其受雇于Tango Therapeutics并持有Tango Therapeutics股票。T. Teng声明其受雇于Tango Therapeutics并持有Tango Therapeutics股票。A. Crystal声明在提交工作之外获得Tango Therapeutics的其他支持，并受雇于Tango Therapeutics且持有Tango Therapeutics股份。W.D. Mallender声明在提交工作之外获得Tango Therapeutics的其他支持，并受雇于Tango Therapeutics且持有Tango Therapeutics股份。X.E. Wu声明有PCT/US2025/061753、PCT/US2025/061754、PCT/US2025/061749和PCT/US2025/061893专利申请中。J.N. Andersen声明其受雇于Tango Therapeutics并持有Tango Therapeutics股票。其他作者未报告任何利益冲突。
作者贡献
H.E. Nicholson：概念设计、数据整理、正式分析、监督管理、验证、调查研究、可视化、方法论、论文撰写–初稿、论文撰写–审阅与修改。D.A. Whittington：数据整理、正式分析、调查研究、可视化、方法论、论文撰写–初稿。F.J. Bruzzese：数据整理、正式分析、验证、调查研究、可视化、方法论、论文撰写–初稿。K. Lazarides：数据整理、正式分析、验证、调查研究、可视化、方法论、论文撰写–初稿。L.C.M. Martires：数据整理、正式分析、验证、调查研究、可视化、方法论。M.R. Tonini：数据整理、正式分析、调查研究、可视化、方法论。H.N. Jenkins：验证、调查研究、可视化、方法论。M. Zhang：概念设计、数据整理、正式分析、调查研究、方法论。P. Shahagadkar：验证、调查研究、可视化、方法论。C.B. Pratt：数据整理、正式分析、调查研究、可视化、方法论。K.J. Briggs：概念设计、监督管理、论文撰写–审阅与修改。P. McCarren：数据整理、调查研究。A.W. Tsai：正式分析、调查研究、方法论。M. Bandi：验证、调查研究、方法论。C. Min：概念设计、调查研究。A. Huang：概念设计、监督管理。H. Zhang：资源支持、验证、调查研究、方法论。S.R. Meier：软件、正式分析、可视化、方法论。B. Shen：资源支持、方法论。Y. Yu：软件、方法论。C. Liang：资源支持、方法论。Y. Liu：资源支持、方法论。T. Teng：数据整理、验证。J. Zhang：资源支持、方法论。A. Crystal：监督管理、论文撰写–审阅与修改。W.D. Mallender：概念设计、监督管理、论文撰写–初稿、论文撰写–审阅与修改。X.E. Wu：监督管理、调查研究、方法论。J.P. Maxwell：概念设计、验证、调查研究、方法论、论文撰写–审阅与修改。J.N. Andersen：概念设计、监督管理、论文撰写–初稿、论文撰写–审阅与修改。
致谢
作者感谢Viva Biotech、凯莱英有限公司（ChemPartner Co. Ltd.）、BioMetas、药明康德（WuXi AppTec）、康龙化成（Pharmaron）、Enamine和PTM Bio的科学团队提供的慷慨贡献。作者也对Margaret A. Wyman和Samy Tadros在本项目中的支持工作表示感谢。作者感谢MIT和哈佛大学布罗德研究所的PRISM团队，特别是Matthew G. Rees和Jennifer A. Roth。PRISM平台全部或部分基于TCGA研究网络生成的数据：https://www.cancer.gov/tcga。注：本文的补充数据可在Cancer Discovery在线版（http://cancerdiscovery.aacrjournals.org/）获取。