TNG961 选择性地损害 FOCAD 阴性细胞的活力，在...

《Cancer Discovery》：TNG961 selectively impairs the viability of FOCAD-negative cells in...

　　

打开图形查看器

摘要

当抑癌基因通过染色体缺失而丢失时，相邻基因的删除可产生治疗性脆弱性。MTAP常与染色体9p21抑癌基因CDKN2A共同缺失，从而产生对蛋白质精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）的合成致死依赖性。FOCAD（focadhesin）位于MTAP端粒侧，其缺失可诱发对HBS1样翻译GTP酶（HBS1L）-蛋白质pelota同源物（PELO）核糖体救援复合物的依赖性以维持翻译功能。在约三分之一的MTAP缺失癌症中，FOCAD发生缺失。我们对一个以免疫调节咪唑类（IMiD）为重点的多样性文库进行了筛选，并鉴定出一个弱命中物，该化合物能结合cereblon（CRBN），促进HBS1L-CRBN-化合物三元复合物的形成，并诱导E3连接酶依赖性的HBS1L泛素化和降解。在冷冻电镜结构和蛋白质组学选择性分析的指导下，我们开发了TNG961，这是一种强效且高选择性的HBS1L降解剂，可破坏HBS1L-PELO复合物，在FOCAD缺失模型中诱导翻译停滞、未折叠蛋白反应激活和生长抑制。口服给药TNG961可消退FOCAD缺失异种移植瘤，包括PRMT5抑制剂难治性模型，确立了HBS1L降解作为利用FOCAD缺失的策略，并支持TNG961作为首创类精准肿瘤治疗药物的临床评估。

意义：FOCAD缺失常与MTAP/CDKN2A共同缺失同时发生，产生了对HBS1L-PELO核糖体救援复合物的合成致死依赖性。TNG961是一种首创类HBS1L分子胶降解剂，可强制翻译停滞并驱动FOCAD缺失模型中的肿瘤消退，包括PRMT5抑制剂难治性肿瘤，为染色体9p21共同缺失背景建立了新的精准肿瘤治疗策略。

引言

抑癌基因的缺失往往导致邻近基因的附带丢失，从而产生不同的情境特异性癌症依赖性（1）。此类"乘客"缺失可能并非肿瘤起始所必需，但在肿瘤进展过程中被保留，从而创造了合成致死治疗策略的机会。一个突出的例子是染色体9p21上MTAP与抑癌基因CDKN2A的共同缺失。MTAP在所有人类癌症中的10%至15%中与CDKN2A共同缺失，MTAP的灭活产生了对甲硫氨酸挽救途径和蛋白质精氨酸甲基转移酶5（PRMT5）的合成致死依赖性（参考文献2-8），从而推动了PRMT5和MAT2A抑制剂在MTAP缺失肿瘤治疗中的临床开发（参考文献9-17）。FOCAD基因位于MTAP的端粒侧，该基因在约三分之一的MTAP缺失癌症中作为同一9p21染色体缺失事件的一部分共同缺失。FOCAD缺失广泛分布于多种肿瘤类型中，包括非小细胞肺癌（NSCLC）和胰腺癌等未满足医疗需求较高的癌症（补充图S1A）。FOCAD基因编码FOCAD蛋白，该蛋白在通过稳定超级杀手（SKI）复合物来维持mRNA质量控制方面发挥关键作用（18，19）。SKI复合物与RNA外切体共同介导异常mRNA种类的降解，否则这些异常mRNA会停滞核糖体并破坏翻译稳态（20-23）。因此，FOCAD的丢失会使SKI复合物不稳定，导致缺陷转录本的积累，并增加对下游核糖体救援途径的依赖性以维持蛋白质合成（24，25）。多项独立的遗传学研究表明，FOCAD丢失产生了对HBS1样翻译GTP酶（HBS1L）-蛋白质pelota同源物（PELO）复合物的选择性依赖性，该复合物功能在于救援停滞的核糖体。在缺乏SKI复合物活性的情况下，该核糖体救援途径成为维持翻译稳态所必需的，从而使FOCAD阴性细胞对HBS1L或PELO的灭活异常敏感。尽管这一引人注目的合成致死相互作用十分明确，但尚无小分子策略被报道可用于治疗性地利用这一脆弱性。靶向蛋白降解已成为一种强大的方法，通过劫持泛素-蛋白酶体系统来攻克以往难以成药的靶点。分子胶降解剂尤其通过稳定E3泛素连接酶与新底物之间的新型蛋白质-蛋白质相互作用来发挥作用，从而实现靶蛋白的选择性泛素化和降解。基于cereblon（CRBN）的分子胶在临床上已取得成功，但实现新底物选择性——尤其是在密切相关的蛋白质之间——仍是一项核心挑战（26）。鉴于HBS1L（又称GSPT3）与相关的翻译终止因子及常见的免疫调节咪唑类（IMiD）降解剂新底物GSPT1之间的高度同源性，通过分子胶降解剂模式来靶向HBS1L颇具吸引力，但鉴定HBS1L的选择性降解剂对这一模式提出了严格考验。在此，我们报告了TNG961的发现及临床前表征（27），TNG961是一种首创类分子胶降解剂，可选择性靶向HBS1L进行CRBN依赖性降解。我们利用细胞与生化双重筛选策略，并结合冷冻电镜分析指导的医药化学优化，开发出TNG961作为一种强效、高选择性的降解剂，可区分HBS1L与密切相关蛋白GSPT1。TNG961介导的HBS1L降解使HBS1L-PELO核糖体救援复合物不稳定化，触发翻译停滞、未折叠蛋白反应（UPR）激活，并在FOCAD阴性细胞中丧失活力，同时不影响FOCAD阳性细胞。在大规模体外表征中，FOCAD丢失被确定为敏感性的主导生物标志物，这与由SKI复合物功能障碍驱动的合成致死相互作用一致。体内，口服给药TNG961在多种不同组织学类型的FOCAD缺失异种移植瘤模型中诱导肿瘤消退，并保留了在PRMT5抑制剂治疗后进展肿瘤中的活性。综合而言，这些发现确立了HBS1L降解作为一种机制独特且具有生物标志物定义的治疗策略，用于利用染色体9p21共同缺失，并支持TNG961作为精准肿瘤治疗药物的临床开发，该药物与现有的MTAP靶向方案具有互补潜力。

结果

FOCAD缺失在癌症中的基因组背景和功能影响

抑癌基因的体细胞缺失常常超出驱动基因座范围。利用cBioPortal对TCGA数据集进行泛癌分析发现，约三分之一的MTAP缺失癌症同时携带FOCAD缺失（图1A；参考文献5，6，28）。几乎所有FOCAD缺失均与MTAP和CDKN2A的丢失同时发生，后者是驱动共同缺失现象的抑癌基因。总体而言，FOCAD变异存在于约6%的癌症病例中，以深缺失为主（24）。其中包括约6%的NSCLC病例，凸显了一个具有高度未满足医疗需求的庞大患者群体。

图1. 点击查看大图并下载幻灯片 FOCAD缺失在癌症中十分常见，并使细胞对HBS1L-PELO复合物产生高度依赖性。A，染色体9p上与CDKN2A邻近基因同MTAP共同缺失的频率。B，FOCAD等基因MIAPACA2细胞全基因组CRISPR筛选的sgRNA水平效应。表达FOCAD cDNA的细胞（FOCAD阳性）或空载体对照细胞（FOCAD阴性）被感染全基因组sgRNA文库，培养14天后提取基因组DNA并进行下一代测序。数据以FOCAD阴性细胞与FOCAD阳性细胞间的log2倍数变化（log2FC）显示。原始CRISPR筛选数据已在此前报道（24）。C，FOCAD失活与HBS1L-PELO复合物之间合成致死相互作用的治疗假说模型。（部分使用BioRender制作，Nicholson, H E. (2023) https://BioRender.com/ralcu3s）

图1. 点击查看大图并下载幻灯片 FOCAD缺失在癌症中十分常见，并使细胞对HBS1L-PELO复合物产生高度依赖性。A，染色体9p上与CDKN2A邻近基因同MTAP共同缺失的频率。B，FOCAD等基因MIAPACA2细胞全基因组CRISPR筛选的sgRNA水平效应。表达FOCAD cDNA的细胞（FOCAD阳性）或空载体对照细胞（FOCAD阴性）被感染全基因组sgRNA文库，培养14天后提取基因组DNA并进行下一代测序。数据以FOCAD阴性细胞与FOCAD阳性细胞间的log2倍数变化（log2FC）显示。原始CRISPR筛选数据已在此前报道（24）。C，FOCAD失活与HBS1L-PELO复合物之间合成致死相互作用的治疗假说模型。（部分使用BioRender制作，Nicholson, H E. (2023) https://BioRender.com/ralcu3s）

关闭 图1. 基于功能基因组学研究（DepMap分析；参考文献19，24，25）和内部CRISPR筛选（24），我们和其他人已经证明，FOCAD的灭活会导致对HBS1L-PELO核糖体救援复合物的显著依赖性。HBS1L是一种翻译GTP酶，其结合伙伴PELO协同作用以解除非终止或无终止mRNA上停滞的核糖体，从而防止翻译崩溃。这种依赖性在全基因组CRISPR筛选（使用FOCAD等基因细胞，24）中得以体现，其中分别靶向HBS1L或PELO的四个独立sgRNA在FOCAD阴性细胞中相对于FOCAD阳性细胞表现出强烈的缺失（图1B）。值得注意的是，HBS1L的敲除在FOCAD阳性和FOCAD阴性条件下表现出最强的差异，表明HBS1L的选择性药理学靶向可能比PELO敲除后观察到的更为明显的泛致死效应提供更优的治疗指数（24）。机制上，FOCAD编码FOCAD蛋白（FOCAD），该蛋白可稳定SKI复合物（18，19），SKI复合物与外切体协同降解异常mRNA，否则这些异常mRNA会停滞核糖体并破坏翻译维持（20-23）。因此，FOCAD丢失破坏了SKI复合物功能，促进缺陷转录本的积累，并使细胞对HBS1L-PELO介导的核糖体救援产生高度依赖性。图1C展示了这一治疗假说：在FOCAD阳性细胞中，FOCAD稳定的SKI复合物促进缺陷mRNA的降解并限制对核糖体救援的依赖；而在FOCAD阴性细胞中，SKI复合物功能的丧失导致核糖体在异常mRNA上的滞留，并对HBS1L-PELO复合物产生关键依赖性以维持翻译。因此，在SKI复合物破坏的背景下，HBS1L-PELO的灭活具有选择性致死性，为在FOCAD缺失癌症中靶向HBS1L提供了有力的治疗依据。

并行细胞与生化筛选鉴定出选择性HBS1L分子胶

我们实施了一种双重筛选策略，以鉴定既能诱导基于HiBiT的细胞靶点降解，又能在生化测定中促进与CRBN形成三元复合物的化合物（图2A）。由于HBS1L是分子胶的开创性靶点，且当时没有商业化的HBS1L-HiBiT敲入细胞系可用，我们通过CRISPR工程在Promega LgBiT HEK细胞的内源性HBS1L基因座敲入HiBiT标签，建立了检测内源性HBS1L降解而非过表达构建体的高通量报告系统。为了提前确保选择性，我们同时生成了N端和C端标记的HBS1L敲入细胞系，并将其与商业化的293T GSPT1-HiBiT敲入细胞系配对，作为反靶点对照筛选。同时，我们在时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）三元复合物测定中筛选了专有分子胶文库，该测定检测化合物诱导的CRBN与HBS1L或GSPT1之间的邻近性。

图2. 点击查看大图并下载幻灯片 命中物发现策略及驱动CRBN依赖性三元复合物形成和选择性降解HBS1L而非GSPT1的分子胶的发现。A，用于鉴定HBS1L分子胶的并行筛选策略示意图。左，基于HiBiT的细胞测定，通过在HBS1L内源性基因座CRISPR敲入HiBiT，实现对靶点降解的高通量检测。右，TR-FRET三元复合物测定，检测配体诱导的CRBN与HBS1L之间的邻近性。在两种测定中均活跃的化合物被优先选中。（部分使用BioRender制作，Teng, T. (2026) https://BioRender.com/14wx5zd；Teng, T. (2026) https://BioRender.com/3lkesgf）B，初始筛选命中物TNG-6266和优化后TNG961的结构与活性总结，涉及细胞降解和三元复合物形成测定。当Bmax < 50%时不报告AC50；DC50和AC50值已进行培养基结合校正。C，化合物在HBS1L-HiBiT降解测定和HBS1L三元复合物形成（诱导邻近性）测定中的表征。颜色表示HBS1L相对于GSPT1的选择性程度，DC50值已进行培养基结合校正。D，TNG-4857、TNG-7535和TNG-7326的活性总结；DC50和AC50值已进行培养基结合校正。E，TNG-4857（黄色）结合在HBS1L（绿色）和CRBN（蓝色）界面，来自HBS1L-CRBN-DDB1复合物2.6 ?分辨率冷冻电镜结构（PDB 11MR）。虚线表示氢键。

图2. 点击查看大图并下载幻灯片 命中物发现策略及驱动CRBN依赖性三元复合物形成和选择性降解HBS1L而非GSPT1的分子胶的发现。A，用于鉴定HBS1L分子胶的并行筛选策略示意图。左，基于HiBiT的细胞测定，通过在HBS1L内源性基因座CRISPR敲入HiBiT，实现对靶点降解的高通量检测。右，TR-FRET三元复合物测定，检测配体诱导的CRBN与HBS1L之间的邻近性。在两种测定中均活跃的化合物被优先选中。（部分使用BioRender制作，Teng, T. (2026) https://BioRender.com/14wx5zd；Teng, T. (2026) https://BioRender.com/3lkesgf）B，初始筛选命中物TNG-6266和优化后TNG961的结构与活性总结，涉及细胞降解和三元复合物形成测定。当Bmax < 50%时不报告AC50；DC50和AC50值已进行培养基结合校正。C，化合物在HBS1L-HiBiT降解测定和HBS1L三元复合物形成（诱导邻近性）测定中的表征。颜色表示HBS1L相对于GSPT1的选择性程度，DC50值已进行培养基结合校正。

D，TNG-4857、TNG-7535和TNG-7326的活性汇总；DC50和AC50值已根据培养基结合进行了校正。E，TNG-4857（黄色）在HBS1L–CRBN–DDB1复合物的2.6 ?分辨率冷冻电镜结构中（PDB 11MR），结合于HBS1L（绿色）与CRBN（蓝色）的界面。虚线表示氢键。关闭图2。

HiBiT细胞筛选进行了稳健的测定（Z′值>0.63），复孔板之间具有高相关性（r2 = 0.662–0.891）。CC-885和CC-90009均作为GSPT1-HiBiT降解的阳性对照，而只有CC-885降解了HBS1L-HiBiT。应用目标降解>20%且活力影响<20%的筛选标准，HBS1L的命中率6.5%，GSPT1的命中率19%。在平行筛选中，三元复合物形成测定同样稳健（平均Z′ = 0.61–0.72；DMSO变异系数CV = 2.2–3.6%）。同样，只有CC-885诱导CRBN与GSPT1和HBS1L之间的邻近。选择信号超过基线三倍CV的化合物，命中率分别为0.58%（HBS1L）和1.52%（GSPT1），在单点后续测定中重新确认率超过70%。从此次筛选活动中，TNG-6266作为初始命中化合物浮现，具有细胞内HBS1L降解（Dmax = 43%，10 μmol/L）和三元复合物形成（Bmax = 17%；图2B）的证据。值得注意的是，TNG-6266未能可测量地降解GSPT1（DC50 > 10 μmol/L；Dmax = 11%）。这些数据提供了选择性降解HBS1L的早期指示，并为最终开发候选药物TNG961提供了令人鼓舞的起点（图2B）。

药物化学

药物化学工作由主要筛选测定指导（HBS1L和GSPT1的HiBiT降解及三元复合物形成；图2C），并结合在NCIH1755 FOCAD同源细胞系对中的7天活力测定。进一步开展基于配体的设计，将该系列推进至代表性化合物TNG-4857（图2D）。在确定TNG-4857驱动HBS1L与CRBN/DNA损伤结合蛋白（DDB1）形成三元复合物的2.6 ?分辨率冷冻电镜结构后（图2E），探索了多种策略，包括将邻氟苯甲酰胺环化为6,6-双环的类似物，如TNG-7535和TNG-7326（图2D）。有趣的是，尽管TNG-7535在HBS1L降解和活力测定中比TNG-4857更有效（DC50 = 1 vs. 12 nmol/L；AC50 = 240 vs. 737 nmol/L），但它也出乎意料地诱导了GSPT1降解（DC50 = 7 nmol/L）。相比之下，萘基类似物TNG-7326进一步提高了HBS1L三元复合物效力（AC50 = 4 nmol/L；较TNG-7535提高184倍），同时保持选择性，未检测到GSPT1降解（DC50 > 10 μmol/L；图2D）。萘基系列的持续优化最终产生了TNG961，基于其体外和体内临床前特征被提名作为临床开发候选药物。

TNG961快速降解HBS1L同时保留GSPT1

在细胞筛选测定中，TNG961处理导致HBS1L近乎完全降解（Dmax = 98%；DC50 = 7 nmol/L，24小时），未影响GSPT1-HiBiT水平，确认了对紧密相关的GSPT1蛋白具有选择性（图3A）。为探究TNG961的降解动力学，采用HBS1L和GSPT1 HiBiT敲入细胞系进行活细胞测定。TNG961处理后，在非裂解条件下每30分钟测量HiBiT信号。与裂解终点HiBiT测定结果一致，TNG961以剂量依赖性方式诱导HBS1L降解（图3B），而GSPT1-HiBiT未显示出类似调节（补充图S1B）。在最高测试浓度下，HBS1L的最大降解在约4小时内达到，并在整个12小时测定中持续抑制，支持TNG961作为快速、强效且选择性降解HBS1L的降解剂。

图3。TNG961介导HBS1L–CRBN复合物形成，导致HBS1L降解及FOCAD依赖性活力丧失。A，用指定浓度TNG961处理293T HBS1L-HiBiT和293T GSPT1-HiBiT敲入细胞系24小时后，通过HiBiT信号测量的HBS1L和GSPT1细胞内降解。数据为均值 ± SD（N = 2个生物学重复；每个2个技术重复）。B，293T HBS1L-HiBiT敲入细胞中HBS1L的活细胞降解动力学，用指定浓度TNG961处理后12小时内通过HiBiT信号测量。数据为均值 ± SD（N = 2个生物学重复）。C，在CUL4A–RBX1–DDB1–CRBN与Avi标记的HBS1L（红色圆圈）或Avi标记的GSPT1（蓝色方块）之间，在增加浓度TNG961存在下进行的TR-FRET三元复合物形成测定。信号（%）以CC-885阳性对照孔为基准标准化。数据为均值 ± SD（N = 3个独立实验；每个2个技术重复）。D，TNG961存在下HBS1L（绿色）结合CRBN–DDB1复合物（蓝色和粉色）的冷冻电镜结构（2.9 ?；PDB 10AY）。E，TNG961（橙色）在CRBN–HBS1L界面的近距离表面视图（PDB 10AY）。描绘了HBS1L的表面，虚线表示氢键。F，CC-885（紫色）在CRBN–GSPT1界面的近距离表面视图（PDB 5HXB）。描绘了GSPT1的表面。关闭图3。

TNG961选择性驱动CRBN–HBS1L三元复合物形成和泛素化

使用TR-FRET三元复合物形成测定，TNG961以剂量依赖性方式选择性地促进Cullin 4A（CUL4A）–RING-box蛋白1（RBX1）–DDB1–CRBN与HBS1L之间的三元复合物形成（AC50值为14.7 nmol/L），而GSPT1的AC50值 > 10 μmol/L（图3C）。相比之下，非特异性GSPT1分子胶降解剂CC-885与GSPT1和HBS1L均形成三元复合物（补充图S1C）。值得注意的是，TNG961达到了比CC-885更高的HBS1L三元复合物形成最大值（Bmax），提示其复合物形成倾向增强和/或复合物稳定性更高。这些结果强调了TNG961诱导HBS1L与功能性CRBN E3连接酶复合物邻近结合的能力，对GSPT1具有高选择性。为进一步评估选择性，我们建立了使用纯化蛋白质组成的泛素化系统（E1、E2和E3复合物）与HBS1L或GSPT1的体外泛素化测定。在这些条件下，CC-885和TNG961均促进HBS1L的ATP依赖性多聚泛素化（补充图S1D）。分子胶降解剂分子的存在对任何蛋白质的可检测多聚泛素化都是必要的。相比之下，TNG961未诱导GSPT1的多聚泛素化（补充图S1E），进一步支持选择性CRBN–HBS1L复合物形成。

HBS1L招募和GSPT1选择性的结构基础

为明确驱动TNG961活性的分子相互作用，我们测定了全长DDB1结合CRBN（氨基酸40–442）和HBS1L（氨基酸478–684）在TNG961存在下的冷冻电镜结构（图3D）。2.9 ?分辨率结构显示，TNG961的戊二酰亚胺-萘部分位于CRBN中已知被其他CRBN靶向分子胶的戊二酰亚胺部分占据的疏水口袋内。HBS1L的降解基环沿此典型口袋的一侧排列。TNG961的脲部分与HBS1L和CRBN的残基形成氢键，而三氟甲基-苯并噻吩基团位于由HBS1L和CRBN残基组成的疏水口袋中（图3E）。HBS1L残基Arg664的胍基跨越苯并噻吩环面，形成阳离子-π堆积排列。最后，TNG961的偕二甲基部分紧邻HBS1L的一个β-折叠片层，并与其形成范德华相互作用。与报道的CC-885结合GSPT1–CRBN–DDB1复合物的晶体结构比较（图3F；参考文献31）表明，CC-885和TNG961占据CRBN结合口袋中重叠的区域。与CC-885已知的非特异性特征一致，其结合模式兼容GSPT1和HBS1L的招募。相比之下，GSPT1相对于HBS1L的表面拓扑差异似乎与TNG961的容纳不兼容，导致预测的空间位阻冲突，这与其实验观察到的选择性特征一致。这些结构观察为TNG961的选择性提供了事后的解释。

TNG961诱导CRBN依赖性内源性HBS1L降解，具有蛋白质组水平的选择性

与HiBiT测定结果一致（图3A），Western印迹分析显示，TNG961在代表多个谱系的四种癌细胞系（NCIH838、MIAPACA2、NCIH1755和RS411）中诱导了内源性HBS1L的强效降解（图4A）。HBS1L结合伙伴PELO的去稳定化也得到了观察，与先前遗传学证据显示HBS1L依赖性PELO稳定性一致。CRBN敲除完全阻断了TNG961介导的HBS1L降解（图4B；补充图S1F），而与neddylation抑制剂MLN4924（TAK924，pevonedistat）联合处理将HBS1L蛋白水平部分恢复至DMSO水平的约50%，确认了cullin依赖性E3连接酶泛素化的必要性（图4C）。

图4。TNG961诱导强效、选择性的CRBN依赖性HBS1L降解。A，用TNG961处理24小时后通过Western印迹测量的指定细胞系中内源性HBS1L降解和PELO去稳定化。最高剂量为10 μmol/L，测试为9点3倍稀释系列。代表性图像来自N = 2个生物学重复。B，用指定浓度TNG961处理24小时后，通过Western印迹在亲本和CRBN敲除（sgCRBN）MIAPACA2细胞中评估的CRBN依赖性HBS1L降解和PELO去稳定化。代表性图像来自N = 2个生物学重复。C，用TNG961单独或与100 nmol/L MLN4924联合处理MIAPACA2细胞24小时后通过Western印迹评估的neddylation依赖性。代表性图像来自N = 2个生物学重复。D，用指定浓度TNG961处理亲本MIAPACA2细胞及表达HBS1L G625N（覆盖内源性HBS1L敲除）或GSPT1 G575N（覆盖内源性GSPT1敲除）的工程细胞系24小时后，通过Western印迹评估的降解基环依赖性。代表性图像来自N = 3个生物学重复。E，MM.1s细胞经500 nmol/L TNG961或DMSO处理6小时后的全局定量蛋白质组学。数据以相对蛋白丰度（TNG961/DMSO）显示；已标注HBS1L、PELO及常见IMiD新底物。F，用指定浓度TNG961处理24小时后，常见CRBN新底物的Western印迹分析。代表性图像来自N = 2个生物学重复。

代表性图像来自N = 3个生物学重复。E、TNG961（500 nmol/L）或DMSO处理MM.1s细胞6小时后的全局定量蛋白质组学分析。数据显示为相对蛋白丰度（TNG961/DMSO）；HBS1L、PELO和常见IMiD新底物已标注。F、TNG961以所示浓度处理24小时后，通过免疫印迹检测常见CRBN新底物的表达情况。代表性图像来自N = 2个生物学重复。关闭图4。CRBN通过保守的降解环与某些新底物相互作用，例如GSPT1中的G575N突变可消除分子胶降解剂MRT-2359介导的CRBN依赖性降解（31, 37）（补充图S1G）。类似地，在HBS1L降解环中引入相应的甘氨酸突变（G625N）可完全消除TNG961诱导的HBS1L降解（图4D），进一步证实了HBS1L被CRBN直接识别。为评估蛋白质组水平的选择性，在MM.1s细胞中进行了全局定量蛋白质组学分析，因为该细胞系表达大多数常见的IMiD靶向新底物。TNG961处理6小时后，HBS1L是最显著改变的蛋白质（图4E；补充数据集S1）。没有其他蛋白质满足预定义的显著性标准（丰度变化≥50%；P < 0.01；≥1个唯一肽段；≥10%序列覆盖度）或在24小时时得到重复验证。TNG961处理24小时后，PELO显著减少，与HBS1L为直接靶标、PELO不稳定化作为HBS1L耗竭的继发性后果这一结果一致（补充图S2A）。如果采用较宽松的P值标准（P < 0.05），NUBPL是24小时时唯一其他相对丰度发生显著变化的蛋白质（补充图S2B，补充数据集S1），但根据蛋白质-蛋白质相互作用网络分析（STRING-db.org），NUBPL与HBS1L-PELO之间没有已知或预测的功能关联。转录因子SALL4是一种CRBN新底物，与IMiD相关的致畸性有关（31, 38），在MM.1s细胞中不表达。因此，我们在Kelly细胞系中评估了TNG961处理对SALL4的影响（补充图S2C）。虽然沙利度胺、泊马度胺和来那度胺处理后SALL4蛋白水平降低，但所有测试剂量的TNG961对SALL4水平均无影响。其他已确定的CRBN新底物（GSPT1、GSPT2、CK1α、Ikaros、Aiolos和Helios）也进行了类似分析，TNG961处理后均未出现显著降解（图4F），支持蛋白质组水平的选择性。

TNG961在体外选择性损害FOCAD阴性细胞的生长并在体内导致肿瘤消退

为评估TNG961处理对细胞活力的影响，我们构建了具有不同FOCAD状态的同基因细胞系对。在不具有内源性FOCAD的非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系NCIH1755中，全长cDNA的重表达使FOCAD蛋白水平恢复到与内源性细胞系相当的水平（补充图S3A）。TNG961以100 nmol/L的效力抑制FOCAD阴性NCIH1755细胞的活力，而FOCAD重建细胞在高达10 μmol/L的浓度下不受影响（图5A）。这100倍的选择性窗口在跨越多个谱系的多组FOCAD同基因配对中得到重现，包括重表达FOCAD cDNA的FOCAD阴性细胞系（NCIH1775、MIAPACA2、MDAMB231）以及敲除FOCAD的FOCAD阳性细胞系（HeLa、HAP1）（图5B；补充图S3B–S3E）。FOCAD阴性细胞与FOCAD阳性细胞生长抑制之间的广泛选择性窗口表明TNG961具有较大的治疗指数潜力。

图5。TNG961在体外选择性损害FOCAD阴性细胞的活力并在体内抑制FOCAD阴性肿瘤的生长。A、TNG961以所示浓度处理FOCAD同基因NCIH1755细胞7天后的相对活力，通过CellTiter-Glo测定。数据为均值±标准差（N = 3个生物学重复）。B、所示亲本模型来源的FOCAD同基因细胞系对经TNG961处理7天后的相对活力，通过CellTiter-Glo测定。HAP1和HeLa为内源性FOCAD阳性，同基因配对通过FOCAD敲除构建；NCIH1755、MIAPACA2和MDA-MB-231为内源性FOCAD阴性，同基因配对通过全长FOCAD cDNA重表达构建。选择性计算为FOCAD阳性细胞中的效力除以FOCAD阴性细胞中的效力。数据为均值±标准差（N = 3个生物学重复）。C、TNG961在一系列内源性FOCAD阴性、FOCAD阳性细胞系中经7天处理后的效力（最高浓度3 μmol/L），通过CellTiter-Glo（活力测定）测定，并调整至游离效力以考虑血清蛋白结合（在不同培养条件下为5%–20%）。游离效力高于最高测试浓度的细胞系在最高剂量处绘制。数据为均值±标准差（每模型N = 2个技术重复）。D、MIAPACA2异种移植荷瘤小鼠连续7天每日两次给药后TNG961的血浆暴露量，以及最后给药后12小时通过免疫印迹评估的相应肿瘤药效学（HBS1L蛋白水平以载体对照条带强度的分数表示）。E–H、以所示剂量每日两次口服TNG961处理所示模型异种移植荷瘤小鼠（每组N = 8只）的肿瘤体积随时间变化。数据为均值±标准误。

图5。TNG961在体外选择性损害FOCAD阴性细胞的活力并在体内抑制FOCAD阴性肿瘤的生长。A、TNG961以所示浓度处理FOCAD同基因NCIH1755细胞7天后的相对活力，通过CellTiter-Glo测定。数据为均值±标准差（N = 3个生物学重复）。B、所示亲本模型来源的FOCAD同基因细胞系对经TNG961处理7天后的相对活力，通过CellTiter-Glo测定。HAP1和HeLa为内源性FOCAD阳性，同基因配对通过FOCAD敲除构建；NCIH1755、MIAPACA2和MDA-MB-231为内源性FOCAD阴性，同基因配对通过全长FOCAD cDNA重表达构建。选择性计算为FOCAD阳性细胞中的效力除以FOCAD阴性细胞中的效力。数据为均值±标准差（N = 3个生物学重复）。C、TNG961在一系列内源性FOCAD阴性、FOCAD阳性细胞系中经7天处理后的效力（最高浓度3 μmol/L），通过CellTiter-Glo（活力测定）测定，并调整至游离效力以考虑血清蛋白结合（在不同培养条件下为5%–20%）。游离效力高于最高测试浓度的细胞系在最高剂量处绘制。数据为均值±标准差（每模型N = 2个技术重复）。D、MIAPACA2异种移植荷瘤小鼠连续7天每日两次给药后TNG961的血浆暴露量，以及最后给药后12小时通过免疫印迹评估的对应肿瘤药效学（HBS1L蛋白水平以载体对照条带强度的分数表示）。E–H、以所示剂量每日两次口服TNG961处理所示模型异种移植荷瘤小鼠（每组N = 8只）的肿瘤体积随时间变化。数据为均值±标准误。关闭图5。

FOCAD缺失是大规模筛选中的主要生物标志物

为进一步评估FOCAD状态作为敏感性决定因素的作用，我们使用7天CellTiter-Glo实验对>90条亲本细胞系进行了筛选，其中包括所有可合理获得的FOCAD阴性模型和大致匹配的FOCAD阳性、组织学匹配的对照细胞系（图5C）。TNG961仅在FOCAD阴性细胞系中表现出强效，大多数FOCAD阳性细胞系在最高测试剂量下未能产生应答。游离效力值≤10 nmol/L的细胞系涵盖广泛的谱系，支持FOCAD缺失作为敏感性的主要遗传驱动因素，而非谱系特异性依赖性。为在大规模水平上进一步确认在靶活性和基因组背景，我们与PRISM实验室（麻省理工学院和哈佛大学布罗德研究所）合作进行了5天多通道活力筛选。在>900条细胞系中，TNG961的敏感性谱与HBS1L和PELO基因敲除特征相关性最强（补充图S4A）。这些数据与我们在体外验证和全局蛋白质组学研究中的结果一致，后者确定HBS1L是TNG961处理后最显著改变的蛋白质。与TNG961敏感性最密切相关的基因表达特征包括FOCAD和KLHL9，后者是另一位于MTAP和FOCAD之间的9p21染色体基因（图1A），且与FOCAD频繁共同缺失（补充图S4B）。总体而言，这些发现支持在更广泛的9p21染色体共同缺失背景下存在强烈的FOCAD依赖性。

口服TNG961产生暴露相关的HBS1L降解和肿瘤消退

为将这些发现转化到体内，我们在MIAPACA2异种移植模型中进行了药代动力学和药效学研究。口服给药TNG961可产生大致呈剂量比例的血浆暴露量（图5D），连续7天每日两次给药后，用于免疫印迹分析的肿瘤显示剂量依赖性的HBS1L降解，与血浆暴露量和分子胶降解剂作用模式一致（图5D）。我们随后评估了肿瘤HBS1L降解是否转化为抗肿瘤活性。移植FOCAD阴性细胞的小鼠每日两次口服TNG961，并监测肿瘤生长。在MIAPACA2来源的异种移植中，治疗导致剂量依赖性肿瘤生长抑制，6 mg/kg剂量下8只小鼠中有3只出现完全消退，20 mg/kg剂量下有7只完全消退（图5E）。所有剂量的TNG961均耐受良好，从体重测量可推断得出（补充图S4C）。剂量依赖性肿瘤生长抑制在另外三个FOCAD阴性模型中重现：NSCLC细胞系NCIH838（图5F）、血液肿瘤细胞系RS411（图5G）和NSCLC细胞系NCIH1755（图5H）。所有模型均对TNG961治疗产生应答，表现为显著的肿瘤生长抑制和良好的耐受性（补充图S4D–S4F）。总体而言，这些结果表明TNG961在多种FOCAD阴性肿瘤类型中具有稳健的体内疗效，支持针对FOCAD缺失癌症的组织学无关开发策略。

TNG961在FOCAD阴性细胞中诱导翻译停滞和未折叠蛋白反应激活，而在FOCAD阳性细胞中则无此效应

我们的数据表明，TNG961介导的HBS1L降解选择性抑制FOCAD阴性细胞在体外和体内的生长。为阐明其机制，我们探讨了TNG961介导的HBS1L降解是否以FOCAD依赖的方式诱导翻译停滞，这与我们的治疗假设一致（图1C）。使用嘌呤霉素掺入实验推断活跃翻译，我们观察到TNG961显著减少了FOCAD阴性MIAPACA2细胞中活跃翻译蛋白的嘌呤霉素掺入，但在FOCAD重建细胞中则未出现此变化（图6A，补充图S5A）。这种翻译变化不太可能是活力下降的结果，因为嘌呤霉素掺入减少先于活力缺陷约5天出现。数据支持这样的模型：在缺乏FOCAD的情况下，HBS1L-PELO复合物的活性对翻译稳态是必需的。

图6。TNG961选择性地在FOCAD缺失细胞中诱导翻译停滞并激活内质网应激和UPR。A、嘌呤霉素掺入测定翻译活性，FOCAD同基因MIAPACA2细胞经所示浓度TNG961处理48小时后。嘌呤霉素免疫印迹强度以Ponceau染色归一化以控制蛋白上样量。柱状图显示均值±标准差（N = 3个生物学重复）。**，与DMSO相比，经双因素方差分析和Sidak多重比较检验，P < 0.01。代表性印迹图见补充图S5A。B、FOCAD同基因MIAPACA2细胞经所示浓度TNG961处理48小时后，通过Simple Western检测HBS1L、IFRD1和vinculin蛋白水平。代表性图像来自N = 2个生物学重复。C、FOCAD同基因MIAPACA2细胞经所示浓度TNG961处理48小时后，通过免疫印迹检测ATF4和vinculin蛋白水平。Tm，春雷霉素（ATF4诱导的阳性对照）。代表性图像来自N = 2个生物学重复。D、表达多西环素（DOX）诱导型FOCAD cDNA的MIAPACA2细胞经所示浓度TNG961处理72小时后，通过免疫印迹检测剪接型XBP1（XBP1s）和actin蛋白水平（?DOX，FOCAD不表达/FOCAD缺失；+DOX，FOCAD表达/FOCAD重建）。代表性图像来自N = 2个生物学重复。E、FOCAD同基因MIAPACA2细胞经所示浓度TNG961处理48小时后，通过qPCR分析CHOP、TRIB3和GADD34 mRNA水平。柱状图显示均值±标准差（N = 4个生物学重复）。*，P < 0.05；**，P < 0.01；***，P < 0.001；****，P < 0.0001，经单因素方差分析和Dunnett多重比较检验（与DMSO相比）。

ANOVA P值（FOCAD缺失）：CHOP P = 0.0044，TRIB3 P < 0.0001，GADD34 P = 0.0016；ANOVA P值（FOCAD重建）：CHOP P = 0.4290，TRIB3 P = 0.0320，GADD34 P = 0.0108。

图6。TNG961选择性地诱导FOCAD缺失细胞的翻译停滞并激活内质网应激和UPR。A，FOCAD同源MIAPACA2细胞经不同浓度TNG961处理48小时后，通过嘌呤霉素掺入评估翻译情况。嘌呤霉素免疫印迹信号强度经丽春红染色归一化以控制蛋白上样量。柱状图表示平均值±SD（N=3个生物学重复）。**，与DMSO相比，P<0.01，采用Sidak多重比较检验的二维ANOVA。补充图S5A展示了代表性印迹。B，FOCAD同源MIAPACA2细胞经不同浓度TNG961处理48小时后，通过Simple Western检测HBS1L、IFRD1和vinculin蛋白水平。代表性图像来自N=2个生物学重复。C，FOCAD同源MIAPACA2细胞经不同浓度TNG961处理48小时后，通过Western印迹检测ATF4和vinculin蛋白水平。Tm，替加环素（ATF4诱导的阳性对照）。代表性图像来自N=2个生物学重复。D，表达多西环素（DOX）诱导型FOCAD cDNA的MIAPACA2细胞（?DOX，不表达FOCAD/FOCAD缺失；+DOX，表达FOCAD/FOCAD重建）经不同浓度TNG961处理72小时后，通过Western印迹检测剪接型XBP1（XBP1s）和actin蛋白水平。代表性图像来自N=2个生物学重复。E，FOCAD同源MIAPACA2细胞经不同浓度TNG961处理48小时后，通过qPCR分析CHOP、TRIB3和GADD34 mRNA水平。柱状图表示平均值±SD（N=4个生物学重复）。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；****，P<0.0001，采用Dunnett多重比较检验的单因素ANOVA（与DMSO相比）。ANOVA P值（FOCAD缺失）：CHOP P=0.0044，TRIB3 P<0.0001，GADD34 P=0.0016；ANOVA P值（FOCAD重建）：CHOP P=0.4290，TRIB3 P=0.0320，GADD34 P=0.0108。

核糖体在遇到非终止型或不可逆型mRNA转录本时会停滞，携带部分翻译的蛋白质，并依赖于HBS1L–PELO复合物进行挽救（39–41）。当HBS1L-PELO活性缺失时，部分翻译蛋白质的积累可触发内质网（ER）应激和UPR激活（19、24、25、42、43）。我们假设，由于SKI复合物失稳和异常mRNA的持续表达，这种效应会在缺乏FOCAD的细胞中被不成比例地放大。与该模型一致的是，TNG961处理选择性地导致FOCAD阴性MIAPACA2细胞中内质网应激标志物IFRD1上调，而在同源FOCAD重建细胞中未观察到诱导（图6B）。在FOCAD敲除的HeLa细胞中也观察到类似结果（TNG961处理后IFRD1上调），但未在FOCAD内源完整的野生型HeLa细胞中观察到（补充图S5B）。同样，我们利用6天药代动力学/药效动力学研究的样本，评估了MIAPACA2异种移植肿瘤中的应激通路激活情况。qPCR结果显示，与溶剂组相比，TNG961治疗肿瘤中IFRD1 mRNA显著上调（补充图S5C），与我们的体外应激反应发现一致。除了IFRD1激活外，我们寻求正交的证据来支持内质网应激和UPR的诱导。ATF4的翻译可以与IFRD1平行激活，是内质网应激反应的经典特征（18、43）。与UPR激活一致，TNG961诱导FOCAD阴性MIAPACA2和HeLa细胞中的ATF4蛋白表达，但在其FOCAD阳性对应细胞中未观察到（图6C；补充图S5D）。内质网应激的另一标志是转录因子XBP1的剪接（44）。在UPR期间，XBP1的未剪接异构体被加工生成替代的活性异构体（XBP1s）。与我们先前的发现一致，TNG961增加了FOCAD阴性MIAPACA2细胞中的XBP1s水平，但在FOCAD重建细胞中未诱导XBP1剪接（图6D）。由于内质网应激信号可驱动与细胞活力丧失相关的下游转录程序，我们接着评估了MIAPACA2和HeLa FOCAD同源细胞对中的UPR相关基因诱导。每组细胞系对均用TNG961处理，并通过qPCR检测CHOP、TRIB3和GADD34的mRNA水平（图6E；MIAPACA2；补充图S5E；HeLa）。与IFRD1和ATF4在蛋白水平上的变化一致，我们观察到FOCAD阴性细胞系中CHOP、TRIB3和GADD34的诱导约为5至10倍，但在FOCAD阳性细胞系中未观察到类似影响。这些发现与已发表的结果相呼应，后者显示HBS1L基因敲除在FOCAD同源细胞中引发类似的转录反应（24）。综合而言，这些数据支持一个模型：TNG961诱导的HBS1L降解触发翻译停滞、内质网应激和UPR激活，选择性地发生在FOCAD阴性细胞中，从而损害细胞活力。

TNG961诱导对PRMT5抑制剂治疗进展的异种移植肿瘤消退

上述研究展示了TNG961在FOCAD阴性肿瘤中的稳健单药活性。鉴于甲基硫腺苷（MTA）协同PRMT5抑制剂的临床前景，以及FOCAD因CDKN2A附带丧失而缺失时伴随MTAP共缺失的事实，我们提出TNG961能否在PRMT5抑制剂治疗进展的MTAP/FOCAD共缺失肿瘤中提供互补活性。为此，我们研究了荷MIAPACA2异种移植瘤的小鼠，给予TNG961或MTA协同PRMT5抑制剂vopimetostat（TNG462；图7A；参考文献9）。TNG961（60 mg/kg）迅速实现完全肿瘤缓解，8只小鼠中有8只在15天内无可测量肿瘤。相比之下，vopimetostat最初抑制肿瘤生长，但肿瘤在约2周后进展，与先前关于MIAPACA2肿瘤使用另一种MTA协同PRMT5抑制剂的报道一致（45、46）。在先前的研究中，我们确定MIAPACA2肿瘤在vopimetostat治疗进展后（此处定义为从第9天观察到的最大反应起肿瘤增长>200%）仍保持MTAP缺失状态并表现出PRMT5抑制作用，表明vopimetostat在进展时仍具有药理学活性（补充图S6A–S6C）。为确定PRMT5抑制剂治疗进展的肿瘤是否仍对HBS1L降解敏感，一组vopimetostat治疗的队列在21天时（观察到肿瘤生长时）切换为TNG961（图7A，黑色箭头）。该组所有肿瘤在药物切换后迅速消退，证明PRMT5抑制剂和TNG961具有互补活性和非重叠的耐药机制。所有治疗均良好耐受，以体重维持为标志（补充图S6D）。

图7。TNG961在PRMT5抑制剂难治性环境中表现出体内活性，并抑制携带FOCAD C端截断的细胞生长。A，荷MIAPACA2异种移植瘤的小鼠口服给药，每日两次，60 mg/kg vopimetostat（TNG462）或60 mg/kg TNG961。21天后（黑色箭头），按指示继续治疗（蓝色和灰色）或从vopimetostat切换为TNG961（红色）。通过游标卡尺测量肿瘤体积（N=8只小鼠/组）。数据为平均值±SEM。B，显示FOCAD和CDKN2A在chr9p21上头尾相对方向的示意图。C，通过跨FOCAD位点铺设的探针进行qPCR检测，定位MDA-MB-231、DAOY和NCIH838细胞中的内源FOCAD截断。黑色片段表示已确认表达的基因组；灰色片段表示阳性探针（黑色）和第一个阴性探针（条形末端）之间的基因组。D，NCIH1755细胞经工程改造表达HA标记的FOCAD cDNA，编码所示的C端截断。通过CellTiter-Glo评估TNG961处理7天后的相对活力。数据为平均值±SD（N=2个生物学重复）。E，Western印迹确认HA标记的FOCAD截断的表达及对应SKIV2L稳定性影响。代表性图像来自N=2个生物学重复。

图7。TNG961在PRMT5抑制剂难治性环境中表现出体内活性，并抑制携带FOCAD C端截断的细胞生长。A，荷MIAPACA2异种移植瘤的小鼠口服给药，每日两次，60 mg/kg vopimetostat（TNG462）或60 mg/kg TNG961。21天后（黑色箭头），按指示继续治疗（蓝色和灰色）或从vopimetostat切换为TNG961（红色）。通过游标卡尺测量肿瘤体积（N=8只小鼠/组）。数据为平均值±SEM。B，显示FOCAD和CDKN2A在chr9p21上头尾相对方向的示意图。C，通过跨FOCAD位点铺设的探针进行qPCR检测，定位MDA-MB-231、DAOY和NCIH838细胞中的内源FOCAD截断。黑色片段表示已确认表达的基因组；灰色片段表示阳性探针（黑色）和第一个阴性探针（条形末端）之间的基因组。D，NCIH1755细胞经工程改造表达HA标记的FOCAD cDNA，编码所示的C端截断。通过CellTiter-Glo评估TNG961处理7天后的相对活力。数据为平均值±SD（N=2个生物学重复）。E，Western印迹确认HA标记的FOCAD截断的表达及对应SKIV2L稳定性影响。代表性图像来自N=2个生物学重复。

FOCAD C端截断表型模拟FOCAD丧失并赋予TNG961敏感性

FOCAD基因与CDKN2A在chr9p21上呈头尾相对方向排列（图7B），使得从CDKN2A延伸的染色体缺失可从3′端截断FOCAD。使用跨FOCAD位点铺设的qPCR探针，我们鉴定出多个携带FOCAD内源3′截断的细胞系（图7C）。MDA-MB-231细胞（图5B）和NCIH838异种移植瘤（图5F），两者均在第20号基因组后截断，对TNG961敏感，表明与SKI复合物稳定化和随之而来的HBS1L合成致死相关的FOCAD功能丧失。我们接着提出，较小的3′截断是否也能表型模拟FOCAD完全丧失，如果如此，界定FOCAD失活所需的最低截断长度。使用内源缺失整个FOCAD基因的NCIH1755细胞，我们表达了一系列C端截断的FOCAD构建体，缺失1至20个氨基酸，并通过7天活力测定评估TNG961敏感性作为FOCAD功能的替代指标（图7D）。全长FOCAD（无截断）和空载体对照（不表达FOCAD）分别作为最大挽救和最大敏感性对照。一个基因组的截断表型模拟了FOCAD完全丧失。虽然1或5个氨基酸的截断保留了与全长FOCAD相当的抗性，10个氨基酸的截断表现出中间表型，但15个氨基酸的截断表型模拟了FOCAD完全丧失并赋予了对TNG961的完全敏感性。因此，仅移除15个C端残基就足以使FOCAD在HBS1L合成致死方面失活。与我们FOCAD稳定SKI复合物的模型一致（图1C），赋予TNG961敏感性的FOCAD截断（15个氨基酸、20个氨基酸或1个基因组）也无法稳定SKI复合物组分SKIV2L，通过Western印迹评估（图7E），而较短的截断保留了SKIV2L稳定性。综合而言，这些数据支持一个模型，即FOCAD的C端对SKI复合物稳定化是必需的，并表明即使携带FOCAD小截断的肿瘤也可能对TNG961治疗有响应。

讨论

生物标志物驱动的临床开发已反复改变肿瘤学实践。早期成功如ERBB2扩增乳腺癌中的HER2靶向治疗有助于确立一种审批开发模板，后来扩展到多种基因型定义的场景，包括EGFR、BRAF、ALK、KRAS和NTRK驱动的癌症（47）。与此同时，合成致死（尤其是PARP抑制剂在BRCA1/2突变肿瘤中）的临床成功验证了更广泛的原则，即抑癌基因丧失可界定可操作的治疗弱点（47）。在这一背景下，染色体9p21缺失是人类癌症中最常见的基因组事件之一，由抑癌基因CDKN2A缺失引起，通常延伸至附近基因如MTAP和FOCAD的附带共缺失（图1A）。在治疗方面，染色体9p21缺失背景已经推动了利用MTAP丧失的合成致死策略的发展，包括MTA协同PRMT5抑制剂（例如vopimetostat、navlimetostat）和MAT2A抑制剂的临床努力。在本研究中，我们描述了TNG961——一种口服、强效且选择性HBS1L分子胶降解剂，旨在利用由染色体9p21纯合缺失造成的额外治疗弱点。FOCAD丧失发生在约三分之一的MTAP缺失癌症中，跨越多种组织学类型（补充图S1A），凸显了广泛的临床治疗机会。FOCAD丧失与HBS1L–PELO核糖体挽救复合物之间的合成致死关系最初通过CRISPR基础的功能基因组学筛选鉴定（图1B），最近已被多个团队独立验证（19、24、25）。

TNG961 是一种新型分子胶降解剂，也是首个利用 HBS1L-FOCAD 合成致死性的药物，其发现基于综合的生物化学和细胞表型筛选（图 2A–C）以及随后的药物化学工作（图 2D 和 E）。在机制上，TNG961 使 HBS1L 与 CRBN 相互靠近，促进三元复合物的形成，从而促进 HBS1L 的泛素化，进而实现靶点降解（图 3A–C；补充图 S1B–S1E）。冷冻电镜结构证实 TNG961 促进了 CRBN–HBS1L 三元复合物的形成（图 3D 和 E），该复合物在体外和细胞内均能进行泛素化，最终在多种细胞系中实现 HBS1L 靶点降解（图 4A）。与这一机制一致，TNG961 诱导的 HBS1L 降解及其导致的 PELO 去稳定化均依赖于 CRBN 和 neddylation（图 4B 和 C；补充图 S1F）。此外，突变 HBS1L 降解环中的保守甘氨酸残基（HBS1L G625N）可完全逆转 TNG961 诱导的 HBS1L 降解（图 4D），这与分子胶降解剂 MRT-2359 靶向 GSPT1 时的 G575N 突变使 CRBN 依赖的降解失效相类似（31, 37）（补充图 S1G）。已获批上市的基于 CRBN 的降解剂，如沙利度胺、来那度胺和泊马度胺，均存在与募集和降解特定新底物（包括 SALL4）相关的已知致畸风险（48）。相比之下，TNG961 对 HBS1L 表现出蛋白质组水平的选择性，对其他已确立的新底物无显著影响（图 4E 和 F；补充图 S2A–S2C），其中 PELO 的减少与失去其结合伙伴 HBS1L 所致的次级去稳定化效应一致。我们观察到 TNG961 处理后经免疫印迹检测 CK1α 呈表观剂量依赖性升高（图 4F），但在整体蛋白质组学分析中未能重现（图 4E；补充图 S2A 和 S2B）。造成这一差异的原因尚不清楚，有待进一步研究，但并不改变 TNG961 对 HBS1L 具有高度选择性的总体结论。功能上，TNG961 选择性导致 FOCAD 阴性而非 FOCAD 阳性模型的活性丧失，在 FOCAD 等基因型细胞系对中选择性达约 100 倍（图 5A 和 B；补充图 S3），对大规模癌症细胞系面板中 FOCAD 阳性细胞的影响极小（图 5C）。9p21 缺失背景在超过 900 个细胞系的 PRISM 筛选中得到进一步确认（补充图 S4A 和 S4B）。其他导致 SKI 复合物失活的遗传改变，如微卫星驱动的 SKI 复合物成员四肽重复结构域 37（TTC37）去稳定化，也被预测会依赖 HBS1L–PELO 功能，突出了这种相互作用的稳健性，并支持了所提出的机制（19, 25）。尽管 SKI 复合物失活的其他机制在我们的 PRISM 筛选中未得分，但这可能源于细胞系中这些改变的占比低或注释不足。在体内，TNG961 表现出剂量比例的药代动力学和药效学特征，HBS1L 降解与暴露量相关（图 5D）。在跨越不同组织学的额外 FOCAD 阴性异种移植模型中，观察到显著的剂量依赖性肿瘤生长抑制和肿瘤消退（图 5E–H；补充图 S4C–S4F），支持 FOCAD 状态而非肿瘤谱系是 TNG961 敏感性的主要驱动因素。在机制上，HBS1L 降解在 FOCAD 阴性细胞中诱导翻译停滞，但在 FOCAD 重建细胞中未观察到此现象（图 6A；补充图 S5A）。翻译停滞及停滞核糖体产生的不完整蛋白积累可触发经典内质网应激标志物的诱导和 UPR 的激活，包括 IFRD1 的诱导、ATF4 的诱导、XBP1 的剪接以及描述详实的下游转录应答（18, 19, 24, 25, 39–44）。我们观察到这些经典内质网应激和 UPR 通路标志物的激活仅选择性地出现在 FOCAD 阴性细胞中（图 6B–E；补充图 S5B–S5E），在肿瘤异种移植模型中 IFRD1 额外被诱导（补充图 S5C）。由于 9p21 上 FOCAD 的功能缺失总是与 MTAP/CDKN2A 缺失同时发生（图 1A），我们的发现促使评估与 PRMT5 或 MAT2A 抑制剂的联合策略。MTA 协同的 PRMT5 抑制剂在 MTAP 缺失的肿瘤类型中具有临床活性（13, 49）；然而，患者在联合治疗中可能获得最大获益。在临床前研究中，MIAPACA2 FOCAD/MTAP 缺失的胰腺导管腺癌（PDAC）异种移植模型对 MTA 协同的 PRMT5 抑制剂产生耐药性（50, 51），但 TNG961 可诱导在使用 vopimetostat 后进展的肿瘤消退（图 7A；补充图 S6），支持这两种模式之间敏感性和耐药机制的非重叠性。综合这些数据，提示 TNG961 可能在更广泛的 chr9p21 共缺失人群中占据独特的临床定位，并与 MTA 协同的 PRMT5 或 MAT2A 抑制剂联合或序贯使用，可能通过互补的作用机制加深和/或延长疗效。尽管临床前数据支持 TNG961 在 FOCAD 缺失的癌症中作为单药治疗使用（无论组织学类型），但本文描述的机制（核糖体救援破坏导致翻译停滞和内质网应激/UPR 激活）提示，由于作用机制的差异，肿瘤特异性联合方案（选择特定的细胞毒或靶向骨架药物）可能具有吸引力。然而，在临床上，标准治疗（SOC）因组织学类型和治疗线数不同而差异显著，使跨组织学的联合策略难以标准化。因此，我们认为 TNG961 最好以单药形式在 FOCAD 缺失的肿瘤中推进，不受组织学限制。一旦确立单药疗效，临床开发路径将分为两条：（i）继续组织学无关的单药扩展和/或（ii）在肿瘤特异性队列（如非小细胞肺癌）中进行聚焦开发，在更早期的治疗线中评估一组预设的标准治疗骨架药物，这些治疗线中的方案定义更为明确。这种单药优先策略得到了 FOCAD 缺失的广泛分布（补充图 S1A）以及 FOCAD 状态（而非谱系）在体外和体内模型中驱动 TNG961 敏感性的支持（图 5）。在 FOCAD 阴性患者选择方面，我们证明 FOCAD 的功能缺失（通过完全缺失或小范围 C 端截断）使细胞对 TNG961 敏感（图 7B–D），并导致 SKI 复合物组分 SKIV2L 去稳定化（图 7E），为 FOCAD 缺失的遗传背景与分子靶点 HBS1L 之间建立了机制联系。值得注意的是，仅约 15 至 20 个 C 端残基的截断即可在功能上模拟 FOCAD 蛋白的完全缺失（图 7D）。这一观察对患者选择生物标志物检测的前瞻性设计具有实际意义，包括抗体表位的选择以最大限度减少假阴性分类，以及对 DNA 测序方法（具有外显子水平的断点分辨率）结果的解释。综合而言，本研究确立了 TNG961 作为口服、强效、高选择性的首创降解剂，靶向 HBS1L/PELO 核糖体救援复合物，验证了 FOCAD 缺失作为可临床应用的生物标志物，并支持包括组织学无关、生物标志物定义的单药治疗以及可行时逐步、适应证量身定制的联合治疗在内的临床开发策略。

方法

关键试剂（补充表 S1）；细胞系和培养条件（补充表 S2）；cDNA、sgRNA 及其他 DNA/RNA 序列（补充表 S3）；以及冷冻电镜数据收集、优化和验证统计（补充表 S4）见补充材料。

化学化合物

MG132 购自 Selleck Chemicals（S2619）。MLN4924 购自 MedChemExpress（HY-70062）。CC-885 购自 MedChemExpress（HY-101488）。TNG-6266 购自 Enamine（Z5000160111）。TNG961 由药明康德合成（批次 WX-TJ-HC-1120-01 和 WX-TJ-HC-1120-02；平均纯度 99.1%）。

蛋白质表达和纯化

全长人 HBS1L（用于生化实验）

表达构建体包含 N 端 6×His 标签、TEV 蛋白酶切割位点和 Avi 标签（His-TEV-Avi-HBS1L），克隆至 pFastBac1（Invitrogen 10359016）并在 Sf9 细胞中表达。通过在昆虫细胞中共表达 BirA 和 HBS1L 实现体内生物素化。在 27°C 下表达 48 小时后，收获细胞并悬浮于缓冲液 A 中[50 mmol/L Tris，pH 8.0；500 mmol/L NaCl，10%（v/v）甘油；1 mmol/L Tris(2-羧乙基)磷-HCl（TCEP）]，加入 10 mmol/L 咪唑、苯并酶（125 U/mL 细胞培养物）和蛋白酶抑制剂混合物（Roche, 05056489001）。通过超声破碎细胞（200 W 功率，3 秒开/3 秒停）。离心两次澄清裂解液（20,300 × g，30 分钟），将上清与 5 mL 预平衡的 Ni-NTA 树脂（QIAGEN, 30230）在 4°C 下孵育 1 小时。将树脂装入柱子，洗涤后，用含梯度增加咪唑（20、50、250 mmol/L）的缓冲液 A 洗脱蛋白质。将洗脱蛋白合并，在 4°C 下与 His 标签 TEV 蛋白酶（1:2 重量比）过夜孵育。将样品重新加样至 Ni-NTA 以去除 TEV 蛋白酶和未消化蛋白。流出液装入用缓冲液 A 平衡的 Strep-Tactin 4Flow 柱子（IBA Lifesciences, 2-1250-010），洗涤后，用含 50 mmol/L 生物素的缓冲液 A 洗脱。合并洗脱组分，浓缩后通过 Superdex 200 10/300 柱子（Cytiva, 28990944）进行凝胶过滤色谱（SEC）进一步纯化，SEC 缓冲液为 10 mmol/L HEPES，pH 7.0；240 mmol/L NaCl；3 mmol/L TCEP。将纯化的蛋白（3.3 mg/mL）分装并储存于 ?80°C。

截短人 HBS1L（用于结构研究）

该构建体编码 N 端 6×His 标签的大肠杆菌麦芽糖结合蛋白（MBP），随后是 TEV 蛋白酶切割位点和 HBS1L（478–684 位；His-MBP-TEV-HBS1L），使用杆状病毒在 Hi-5 昆虫细胞中于 27°C 下表达 48 小时。裂解和通过 TEV 切割纯化按全长 HBS1L 的方法进行。在第二次 Ni-NTA 步骤后，流出液装入用含 250 mmol/L NaCl 的缓冲液 A 平衡的 Resource S 柱子（Cytiva, 17118001），通过梯度洗脱至 1.0 mol/L NaCl 洗脱蛋白质。合并洗脱组分，浓缩后通过 Superdex 75 10/300 柱子（GE HealthCare）进行 SEC 纯化，最终缓冲液为 10 mmol/L HEPES，pH 8.0；240 mmol/L NaCl，3 mmol/L TCEP；5% 甘油。将纯化的蛋白（8.4 mg/mL）分装并储存于 ?80°C。

全长人 GSPT1（用于生化实验）

该构建体克隆至 pET21a 并在大肠杆菌 BL21-Gold(DE3) 中表达。构建体包含 N 端 6×His 标签、SUMO 标签和 Avi 标签（His-SUMO-Avi-GSPT1）。当 OD600 = 0.6 时，用 0.2 mmol/L IPTG 诱导表达 12 小时，温度为 16°C。收获细胞并悬浮于加入 10 mmol/L 咪唑、1 mmol/L 苯甲基磺酰氟（PMSF）和 25 U/mL 苯并酶的缓冲液 A 中。通过超声破碎细胞，并通过离心澄清（20,300 × g，30 分钟）。将上清与 10 mL 预平衡的 Ni-NTA（QIAGEN, 30230）在 4°C 下孵育 1 小时，洗涤后，用含梯度咪唑（20、50、250 mmol/L）的缓冲液 A 洗脱。将洗脱蛋白合并，在 4°C 下与 Ulp1 蛋白酶（1:100 重量比）过夜孵育，同时透析至 50 mmol/L Tris，pH 8.0；75 mmol/L NaCl；7.5 mmol/L MgCl2；1 mmol/L TCEP。然后加入 His-BirA（1:150 重量比）、0.5 mmol/L 生物素和 1 mmol/L ATP，在 18°C 下孵育 4 小时进行生物素化。将样品通过 Ni-NTA 以去除 His-BirA 和未消化蛋白。流出液装入 HiTrap Heparin HP 柱子（Cytiva, 17040601），在含 50 mmol/L Tris，pH 8.0；10% 甘油；1 mmol/L TCEP 的缓冲液中用 50 mmol/L 至 1.0 mol/L NaCl 线性梯度洗脱。合并组分，浓缩后通过 Superdex 200 10/300 柱子（10 mmol/L HEPES，pH 7.0；240 mmol/L NaCl；3 mmol/L TCEP）进行 SEC 精制。将纯化的蛋白（4.9 mg/mL）分装并储存于 ?80°C。

CRBN–DDB1 复合物

对于三元复合物形成实验，CUL4A–RBX1–DDB1–CRBN 购自商业渠道（R&D Systems, E3-650 或 ChemPartner 202401264101）。对于冷冻电镜研究，CRBN（40–442）与全长 DDB1 按先前描述的方法在昆虫细胞中表达，除了 CRBN 构建体中的凝血酶切割位点被 TEV 切割位点替换外。初始 Ni-NTA 纯化按全长 HBS1L 的方法进行；CRBN–DDB1 在 20 和 50 mmol/L 咪唑组分中洗脱。将合并的组分在 4°C 下与 TEV 蛋白酶（1:10 重量比）过夜孵育，并重新加样至 Ni-NTA 以去除 TEV 蛋白酶和未消化蛋白。将流出液和 20 mmol/L 咪唑洗脱液中的 CRBN–DDB1 稀释至 50 mmol/L NaCl 浓度，装入用含 50 mmol/L Tris，pH 8.0；10% 甘油；1 mmol/L TCEP 的缓冲液平衡的 HiTrap Heparin HP 柱子（Cytiva, 17040601）；污染物结合到树脂上，CRBN–DDB1 收集于流出液中。该复合物通过 Superdex 200 26/600 柱子（Cytiva, 28989336）进行 SEC 进一步纯化，缓冲液为 10 mmol/L HEPES，pH 7.0；240 mmol/L NaCl；3 mmol/L TCEP。将纯化的蛋白浓缩至 >16 mg/mL，分装并储存于 ?80°C。

冷冻电镜

复合物组装和网格制备

HBS1L–CRBN–DDB1 + TNG-4857 和 TNG961 复合物在制备网格前通过共纯化组装。HBS1L（478–684）与 CRBN（40–442）/DDB1 以 1:1（摩尔比）混合，加入 3.3 倍摩尔过量的胶合化合物，在 10 mmol/L HEPES，pH 7.0；250 mmol/L NaCl；3 mmol/L TCEP 中，于 4°C 下过夜孵育，并通过 Superdex 200 10/300 进行 SEC 纯化。

SEC的单一峰中包含了全部三种蛋白，经SDS-PAGE证实。将纯化的复合物（8 mg/mL）与0.2% n-octylglucoside混合后，立即用于网格制备。将样品滴加至经辉光放电处理的UltrAuFoil金网格（R1.2/1.3，300目；Electron Microscopy Sciences，Q350AR13A）上，吸水2秒，然后使用Vitrobot IV（Thermo Fisher Scientific，RRID:SCR_025773）在8°C、100%湿度条件下液乙烷中固化成冰。

数据采集与处理

数据在配备Falcon 4i探测器（以计数模式运行）（Viva Biotech）的300 kV Titan Krios G4（Thermo Fisher Scientific）上采集。电影片以130,000倍放大倍数记录（像素大小0.932 ?），总剂量为48 e?/?2，分为40帧。TNG-4857和TNG961分别采集了16,029和9,532部电影片，欠焦范围为?1.0至?2.2 μm，使用Selectris X能量滤波器（20 eV狭缝宽度）。处理在RELION v5.0（RRID:SCR_016273）中完成，包括运动校正和传递函数（Contrast Transfer Function (CTF)）估算，随后进行自动挑粒和颗粒提取。对于TNG961，约4.5 mol/L的颗粒进入2D分类、从头重建和3D分类流程。从最佳分类中选取的898,000个颗粒经过额外的3D分类、CTF优化和3D优化，最终获得669,000个颗粒，重建出全局分辨率为2.9 ?的图谱。对于TNG-4857，约10 mol/L的初始颗粒经相同流程优化后，获得661,000个颗粒用于构建最终图谱。初始模型通过刚体对接CRBN/DDB1（PDB 5HXB）和HBS1L（未发表）生成，随后在Coot（RRID:SCR_014222）和Phenix（RRID:SCR_014224）中进行迭代优化。图形在PyMOL（Schr?dinger，RRID:SCR_000305）中生成。冷冻电镜数据采集、优化和验证统计数据见补充表S4。

细胞系工程改造与细胞培养

细胞培养

细胞在37°C、含5% CO2的湿润培养箱中培养。每周使用MycoAlert（Lonza，LT07-318）进行支原体检测。细胞系经短串联重复序列图谱分析鉴定（LabCorp），并在≤15代及解冻后8周内使用。细胞系来源、培养条件、质粒插入序列及关键试剂列于补充表S1–S3。

慢病毒转导

为构建稳定细胞系，将目标质粒和包装混合物（Cellecta，CPCP-K2A）与Lenti-X细胞（Takara Bio，632180）混合，使用Lipofectamine 3000（Thermo Fisher Scientific，L3000015）在Opti-MEM（Gibco，31985-062）中进行转染，过夜培养。16至24小时后，用新鲜DMEM + 30% FBS替换培养基。转染后48小时收集病毒上清液并过滤（0.45 μm）。目标细胞用含8 μg/mL多聚鸟氨酸（Sigma-Aldrich，TR-1003）的病毒培养基过夜感染。细胞恢复培养24小时后，根据构建体的抗性基因盒使用抗生物质筛选——使用blasticidin（Gibco，A1113903）、嘌呤霉素（Gibco，A1113803）或遗传霉素（Gibco，10-131-035）。

HiBiT CRISPR基因敲入细胞系

HBS1L-HiBiT细胞通过将HiBiT敲入HEK293（LgBiT）细胞（Promega，N2672）的HBS1L内源位点而获得，使用基于核糖核蛋白（RNP）的CRISPR编辑流程。配制24 μmol/L的tracrRNA:crRNA双链体：将100 μmol/L Alt-R Cas9 crRNA和100 μmol/L Alt-R Cas9 tracrRNA在双链缓冲液中混合，加热至95°C 5分钟，冷却至室温。加入TruCut Cas9（20 μmol/L），孵育10至20分钟形成RNP；核转染的最终RNP浓度为4 μmol/L。细胞用无酶试剂（Sigma，C5914）悬浮，离心收集（90 × g，10分钟，室温），重悬于SF缓冲液（Lonza，V4XC-2032）中。每次核转染使用2 × 10^6个细胞、4 μmol/L RNP、100 μmol/L供体模板（IDT）和100 μmol/L电转增强剂（IDT，1075915），以25 μL体积使用4D-Nucleofector X Unit（Lonza，AAF-1003X；RRID SCR_023155；程序CM-130；两个脉冲）递送。细胞在预热培养基（80 μL）中恢复，转移至六孔板，并用青霉素-链霉素培养。为评估HiBiT表达，将1 × 10^4个细胞接种在40 μL中，以三重复方式接种于白色384孔板中，同时加入HEK293 GSPT1-HiBiT阳性对照细胞（Promega，CS3023106）；仅培养基孔作为背景。平衡15分钟后，加入2×裂解试剂（Promega，N3040；配制方法：每1 mL裂解缓冲液混合20 μL底物）（40 μL/孔），室温振荡20分钟。在PHERAstar（RRID SCR_027001）或EnVision（RRID SCR_018038）读板仪上测量发光信号（PHERAstar：增益3600，0.1秒积分时间；EnVision：0.5秒积分时间）。从阳性群体中分离单细胞克隆，并通过PCR和测序确认HiBiT正确整合。

HiBiT检测

终点（裂解）HiBiT检测

将细胞以每孔10,000个细胞接种于384孔板中，使用含10% FBS的DMEM培养，过夜贴壁。然后加入化合物并孵育24小时，之后按照制造商说明使用Nano-Glo HiBiT Lytic Detection System（Promega，N3040）检测HiBiT标记蛋白。使用EnVision读板仪（Revvity，RRID SCR_018038）在0.1秒积分时间下测量发光信号。

活细胞动态HiBiT检测

将细胞以每孔20,000个细胞接种于384孔板中，使用无CO2依赖培养基（Invitrogen，18045088）补充1 mmol/L丙酮酸钠（Thermo Fisher Scientific，11360070）、2 mmol/L L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，25030081）和1×青霉素-链霉素（Thermo Fisher Scientific，15140163）培养，过夜贴壁。次日，按照制造商说明加入Nano-Glo Endurazine Live Cell Substrate（Promega，N2570）并孵育2小时。随后加入处理药物，立即使用PHERAstar读板仪（BMG，RRID: SCR_027001）在指定时间间隔测量发光信号。

TR-FRET三元复合物形成检测

在ChemPartner（中国）进行TR-FRET邻近检测以定量化合物诱导的三元复合物形成。将CC-885和TNG961使用Echo550声学分配仪（Labcyte，RRID:SCR_027476）分配至PerkinElmer OptiPlate-384板中（最高浓度10 μmol/L终浓度；10个点、3倍系列稀释）。在1×检测缓冲液（50 mmol/L HEPES，pH 8.0；50 mmol/L NaCl；5 mmol/L MgCl2；0.01% BSA；0.05% Tween-20；1 mmol/L TCEP）中组装反应体系：加入5 μL 2× His标签CUL4A–RBX1–DDB1–CRBN复合物（GSPT1反应为25 nmol/L，HBS1L反应为50 nmol/L；ChemPartner，20240126410），然后加入5 μL 2× Avi标签蛋白（HBS1L 50 nmol/L或GSPT1 25 nmol/L；Viva ID如上所列）。室温孵育1小时后，加入10 μL 2×检测混合物（0.67 nmol/L anti–6×His-Tb加密复合物Gold，Revvity，61HI2TLB；83.33 nmol/L链霉亲和素-XL665，Revvity，610SAXLB）。板离心（1,000 rpm，30秒）并在25°C孵育3小时。在EnVision读板仪（Revvity；激发340 nm；发射615/665 nm，RRID:SCR_018038）上读取TR-FRET信号。信号计算为665/615比值，并使用%Activation = 100 × (Ratio ? Min)/(Max ? Min)转换为活化百分比，其中Max定义为10 μmol/L CC-885，Min定义为仅DMSO孔。剂量-反应曲线在XL-Fit（模型205）中拟合以确定AC50值。Bmax表示相对于检测对照的最大三元复合物信号。

先导化合物筛选（平行筛选）

通过定制合成和商业购买（Enamine）组装了一个专有的CRBN靶向分子胶化合物库，以384孔板中10 mmol/L DMSO储备液形式提供。小分子库包含约3,500个类药化合物（平均分子量 = 429 g/mol），含有CRBN靶向（如谷氨酸酰亚胺类）和其他E3靶向弹头（如DCAF15）。该库通过以下两种方法平行筛选：(i) 在HBS1L-HiBiT和GSPT1-HiBiT工程化细胞中进行HiBiT终点降解检测（10 μmol/L；24小时；终体积40 μL；1.25% DMSO）；(ii) TR-FRET三元复合物检测（筛选条件：1 μmol/L；1% DMSO；20 μL体积；HBS1L 25 nmol/L，GSPT1 12.5 nmol/L；0.33 nmol/L Mab Anti–6HIS-Tb加密复合物Gold和41.67 nmol/L链霉亲和素-XL665检测混合物）。板布局见补充图S7A和S7B，细胞筛选中包含CC-885和CC-90009作为GSPT1降解剂对照；CC-885作为三元复合物筛选的阳性对照。细胞筛选和三元复合物筛选均设双重复（N = 2），计算重复板之间的统计学性能和相关性（补充图S7C–S7E）。符合标准（降解>20%，活力损失<20%）的化合物在单点和剂量-反应HiBiT检测中确认，并进一步通过蛋白酶体抑制（MG132）和NEDD8激活酶抑制（MLN4924、pevonedistat）敏感性验证。三元复合物筛选的化合物在单点和剂量-反应TR-FRET检测中确认。

体外泛素化检测

分子胶介导的泛素化反应（20 μL）包含25 nmol/L UBA1（South Bay Bio，SBB-CE0011）、25 nmol/L UBE2D1（South Bay Bio，SBB-CE0021）、20 nmol/L CUL4A–RBX1–DDB1–CRBN（ChemPartner，20240126410）、1 μmol/L泛素（LifeSensors，SI-0201-5000）、100 μmol/L ATP（Thermo Fisher Scientific，R0441）、20 nmol/L HBS1L或GSPT1（Viva，ID如上所列），以及10 μmol/L CC-885（阳性对照）或TNG961，在检测缓冲液中（ChemPartner）。阴性对照省略ATP或目标蛋白。反应在25°C孵育3或24小时，用4×十二烷基硫酸锂（LDS）样品缓冲液淬灭。每个样品（每泳道10 ng目标蛋白）在NuPAGE Novex 4%至12% Bis-Tris凝胶上电泳分离，转移至0.2 μm硝酸纤维素膜（iBlot）。膜在Odyssey封闭缓冲液中封闭1小时（LICORbio，927-50000），4°C过夜孵育一抗（抗泛素P4D1，CST，#3936；抗HBS1L，Proteintech，10359-1-AP；抗GSPT1，CST，14980S；均1:1,000稀释）。TBST洗涤（50 mmol/L Tris，pH 7.0；150 mmol/L NaCl；0.05% Tween-20）后，室温孵育1小时LICOR二抗（抗小鼠926-68072或抗兔926-32213；1:10,000稀释），洗涤后在Odyssey系统上成像（扫描设置169 μm，中等质量，RRID:SCR_023227）。

免疫印迹

Western Blot

细胞用冰冷的1× PBS冲洗一次，然后直接用添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Life Technologies，78445）的RIPA缓冲液（Life Technologies，89901）进行裂解。裂解液在20,000 × g离心10分钟澄清。蛋白浓度使用BCA蛋白测定（Thermo Fisher Scientific，23227）或Pierce 660 nmol/L蛋白测定（Thermo Fisher Scientific，22660）定量。向裂解液中加入等体积含二硫苏糖醇（DTT；Thermo Fisher Scientific，B0008/B0009）的LDS样品缓冲液，95°C加热5至10分钟。蛋白在4%至12% Bis-Tris凝胶（Thermo Fisher Scientific，WG1402BOX；20–40 μg/泳道）上电泳分离，转移至硝酸纤维素膜（Thermo Fisher Scientific，IB33002）。

Simple Western（Jess）

细胞沉淀用添加蛋白酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific，1861281）和通用核酸酶（VVR，PI88701）的RIPA缓冲液（Thermo Fisher Scientific，89900）裂解。裂解液在10,000 × g、10分钟、4°C条件下离心澄清，使用Pierce Rapid Gold BCA（Thermo Fisher Scientific，A53225）测定蛋白浓度。Simple Western分析在Jess（Bio-Techne，RRID:SCR_025095）上按照制造商方案进行，使用Compass软件v6.2.0分析。抗体来源和稀释比例见补充表S1。

全局蛋白质组学

细胞（MM.1s）按指示处理后，沉淀迅速液氮冷冻并在?80°C保存。冷冻沉淀在液氮下研磨，用含1%蛋白酶抑制剂（4倍样品体积）的1% SDS裂解，随后超声破碎。裂解液在12,000 × g、10分钟、4°C条件下离心澄清，通过BCA法测定蛋白浓度。蛋白用丙酮沉淀（先混合1体积冷丙酮，再加4体积冷丙酮；?20°C 2小时），离心（4,500 × g，5分钟），冷丙酮洗涤2至3次后干燥。沉淀重悬于三乙胺碳酸氢盐（TEAB）（终浓度200 mmol/L）中，超声处理，过夜胰蛋白酶消化（1:50，w/w）。样品用DTT（5 mmol/L；56°C，30分钟）还原，碘乙酰胺（11 mmol/L；15分钟，避光，室温）烷基化。肽段溶解于溶剂A（0.1%甲酸，2%乙腈/水）中，加载至反相分析柱（25 cm，内径100 μm）。肽段在NanoElute UHPLC（Bruker，RRID:SCR_026972）上使用溶剂A和溶剂B（0.1%甲酸/乙腈）分离，梯度条件如下（流速450 nL/分钟）：0至70分钟，B相6%至24%；70至84分钟，B相24%至35%；84至87分钟，B相35%至80%；87至90分钟，B相80%。数据在timsTOF Pro（RRID SCR_026544）上以dia-PASEF模式采集（全MS/MS扫描范围100–1,700；每循环10次PASEF MS/MS扫描）。

**细胞活力测定（CellTiter-Glo）**

将细胞接种于96孔板中，使终点时达到约80%汇合度，并静置过夜使其贴壁，次日进行药物处理。化合物处理7天后，按照制造商说明使用CellTiter-Glo（Promega，G9241）测定ATP水平作为细胞活力的替代指标。使用EnVision酶标仪（Revvity，SCR_018038）测量发光信号。

**异种移植研究**

体内研究在中国药明康德（Pharmaron）进行，遵循机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案及国际实验动物评估与认可协会（AAALAC International）指南。雌性6至8周龄小鼠按以下方式在侧腹部皮下接种：MIAPACA2，1×10?个细胞接种于BALB/c裸鼠（江苏启明生物，JCYK），肿瘤起始体积约150至200 mm3；NCIH838，1×10?个细胞接种于BALB/c裸鼠（JCYK），起始体积约150 mm3；RS411，1×10?个细胞接种于NOD SCID小鼠（AKYB），起始体积约100至150 mm3；NCIH1755，1×10?个细胞接种于NOD SCID小鼠（AKYB），起始体积约100至150 mm3。TNG961配制成10% DMSO/70% PEG400/20%水的溶液，vopimetostat配制成5% DMA/20% Captisol的水溶液。使用游标卡尺每周测量肿瘤两次，体积按（长×宽×宽）/2计算。体重用于给药监测，每日监测、每周记录两次。在指示条件下采集血液进行药代动力学分析，并收集肿瘤进行药效学分析。

**嘌呤霉素掺入试验**

将细胞接种至终点时达到70%至80%汇合度。处理结束后，移除培养基，用PBS（Invitrogen，10010001）洗涤细胞。在预热培养基中加入嘌呤霉素（20 μmol/L；货号见补充表S1），于37°C孵育15分钟。用冰冷PBS洗涤细胞后，直接在孔板中使用含Halt蛋白酶/磷酸酶抑制剂（Thermo Fisher Scientific，78446）的冰冷RIPA裂解液（Thermo Fisher Scientific，89900）裂解细胞。取等量蛋白在4%至12% Bis-Tris胶（Thermo Fisher Scientific，WG1403）上进行电泳分离，使用抗嘌呤霉素抗体（Sigma-Aldrich，MABE343）检测嘌呤霉素标记的新生肽。嘌呤霉素信号以丽春红染色（Thermo Fisher Scientific，A40000279）进行归一化。

**qPCR**

细胞用DPBS洗涤后，在含有RNasin（Promega，N2515；1:40）的RNA细胞裂解液（Boston Bioproducts，R-108）中裂解。按照制造商说明使用TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix（Life Technologies，4444436）及补充表S1中列出的探针。RPLP0作为参考基因。使用ΔΔCt法与DMSO处理对照相比计算相对mRNA水平。

**数据分析（GraphPad PRISM、ImageJ及Spotfire可视化）**

数据分析使用GraphPad Prism（GraphPad Software，RRID SCR_002798）和Spotfire（TIBCO Software，RRID SCR_008858）完成。常规Western blot的灰度值测定在ImageJ（NIH，RRID SCR_003070）中进行。

**数据可用性**

支持本研究结果的数据可向通讯作者请求获取。TNG-4857和TNG961与HBS1L–CRBN–DDB1复合体结合的结构的原子坐标已分别以登录号11MR和10AY存入蛋白质数据银行（PDB）。相关的冷冻电镜地图已以登录号EMD-75840和EMD-75038存入EMDB数据库。

**作者声明**

H.E. Nicholson报告了与Tango Therapeutics的雇佣关系及持有Tango Therapeutics股票。D.A. Whittington报告了来自Sesame Therapeutics的个人费用（与本投稿工作无关）及与Tango Therapeutics的雇佣关系和持有Tango Therapeutics股票。F.J. Bruzzese报告了与Tango Therapeutics的雇佣关系及持有Tango Therapeutics股票。K. Lazarides报告了与Tango Therapeutics的雇佣关系及持有Tango Therapeutics股票。M.R. Tonini报告了与Tango Therapeutics的雇佣关系。H.N. Jenkins报告了与Tango Therapeutics的雇佣关系及持有Tango Therapeutics股票。P. Shahagadkar报告了与Tango Therapeutics的雇佣关系及持有Tango Therapeutics股票。K.J. Briggs报告了与Tango Therapeutics的雇佣关系及持有Tango Therapeutics股票。A.W. Tsai报告了与Tango Therapeutics的雇佣关系及持有Tango Therapeutics股份。C. Min报告了来自Tango Therapeutics的其他支持（与本投稿工作无关）。A. Huang报告了持有Tango Therapeutics股份，且A. Huang是Tango Therapeutics的顾问。S.R. Meier报告了与Tango Therapeutics的雇佣关系及持有Tango Therapeutics股份。B. Shen报告了与Tango Therapeutics的雇佣关系及持有Tango Therapeutics股票。Y. Yu报告了与Tango Therapeutics的雇佣关系及持有Tango Therapeutics股票。C. Liang报告了一项关于工艺和晶型的专利申请（待审），以及与Tango Therapeutics的雇佣关系和持有Tango Therapeutics股票。Y. Liu报告了与Tango Therapeutics的雇佣关系及持有Tango Therapeutics股票。T. Teng报告了与Tango Therapeutics的雇佣关系及持有Tango Therapeutics股票。A. Crystal报告了来自Tango Therapeutics的其他支持（与本投稿工作无关），以及与Tango Therapeutics的雇佣关系和持有Tango Therapeutics股份。W.D. Mallender报告了来自Tango Therapeutics的其他支持（与本投稿工作无关），以及与Tango Therapeutics的雇佣关系和持有Tango Therapeutics股份。X.E. Wu报告了PCT/US2025/061753、PCT/US2025/061754、PCT/US2025/061749和PCT/US2025/061893的专利申请（待审）。J.N. Andersen报告了与Tango Therapeutics的雇佣关系及持有Tango Therapeutics股票。其他作者未报告利益声明。

**作者贡献**

H.E. Nicholson：构思、数据管理、形式分析、监督、验证、调查、可视化、方法学、撰写——初稿、撰写——审阅与编辑。D.A. Whittington：数据管理、形式分析、调查、可视化、方法学、撰写——初稿。F.J. Bruzzese：数据管理、形式分析、验证、调查、可视化、方法学、撰写——初稿。K. Lazarides：数据管理、形式分析、验证、调查、可视化、方法学、撰写——初稿。L.C.M. Martires：数据管理、形式分析、验证、调查、可视化、方法学。M.R. Tonini：数据管理、形式分析、调查、可视化、方法学。H.N. Jenkins：验证、调查、可视化、方法学。M. Zhang：构思、数据管理、形式分析、调查、方法学。P. Shahagadkar：验证、调查、可视化、方法学。C.B. Pratt：数据管理、形式分析、调查、可视化、方法学。K.J. Briggs：构思、监督、撰写——审阅与编辑。P. McCarren：数据管理、调查。A.W. Tsai：形式分析、调查、方法学。M. Bandi：验证、调查、方法学。C. Min：构思、调查。A. Huang：构思、监督。H. Zhang：资源、验证、调查、方法学。S.R. Meier：软件、形式分析、可视化、方法学。B. Shen：资源、方法学。Y. Yu：软件、方法学。C. Liang：资源、方法学。Y. Liu：资源、方法学。T. Teng：数据管理、验证。J. Zhang：资源、方法学。A. Crystal：监督、撰写——审阅与编辑。W.D. Mallender：构思、监督、撰写——初稿、撰写——审阅与编辑。X.E. Wu：监督、调查、方法学。J.P. Maxwell：构思、验证、调查、方法学、撰写——审阅与编辑。J.N. Andersen：构思、监督、撰写——初稿、撰写——审阅与编辑。

**致谢**

作者感谢Viva Biotech、ChemPartner Co. Ltd.、BioMetas、药明康德（WuXi AppTec）、药明康德（Pharmaron）、Enamine和PTM Bio的科学团队的慷慨贡献。我们感谢Margaret A. Wyman和Samy Tadros对本项目的支持工作。感谢MIT与哈佛大学Broad研究所的PRISM团队，特别是Matthew G. Rees和Jennifer A. Roth。PRISM平台全部或部分基于TCGA研究网络产生的数据：https://www.cancer.gov/tcga。注：本文的补充数据可在Cancer Discovery在线（http://cancerdiscovery.aacrjournals.org/）获取。