基于纳米CT与高通量图像分析的同轴颗粒打印生物材料中镁分布与释放的结构-功能关系研究

《Materials & Design》：Structure–function insights into magnesium distribution and release in co-axial pellet-printed biomaterials via nano-CT and high-throughput image analysis

　　

整合了纳米计算机断层扫描（nano-CT）、基于CellProfiler的高通量图像分析和镁离子（Mg2+）释放曲线分析，以建立同轴颗粒打印骨支架中的结构-功能关系。通过基于颗粒挤出的3D打印过程中的一步法同轴喷嘴，实现了镁颗粒的可控空间分布和形态。定量地将镁颗粒形态计量学（尺寸、分布、定位）与挤出参数和支架结构联系起来。论证了镁分布对离子释放动力学和生物相容性性能的影响。建立了一个可扩展的、数据驱动的工作流程，用于优化用于骨组织工程应用的多材料同轴生物材料。

论文解读文章

研究背景与研究动机

在骨组织工程领域，如何精确控制生物活性添加剂（特别是矿物颗粒）在支架内的空间分布，是决定其生物相容性、降解行为和再生性能的关键。镁（Mg）化合物因其良好的生物相容性和通过释放镁离子（Mg²⁺）刺激骨再生的能力而备受关注。然而，不受控或过度的镁分散会损害细胞行为和组织愈合。因此，精确定位镁的位置对于调节支架降解和离子释放动力学至关重要。聚己内酯（PCL）作为一种生物相容性好、可生物吸收的聚合物，是理想的载体基质。

先前的研究表明，短暂的早期Mg²⁺爆发释放比持续高浓度暴露更有利于成骨。这促使研究人员开发一种同轴3D打印策略，将镁盐定位在支架的外壳层而非整个本体中，从而利用核-壳纤维结构实现可控的早期释放。尽管已有研究证明了多材料颗粒基3D打印的可行性，但由于缺乏空间分辨分析，人们对打印结构和局部成分如何决定支架功能的了解有限。本研究旨在解决这一难题，通过集成纳米CT、高通量图像分析和离子释放研究，系统评估同轴颗粒打印支架的结构-组成-性能关联。

研究内容与结论

研究人员开发并验证了一套集成的实验与分析工作流程。首先，利用一步法同轴颗粒打印技术成功制备了具有清晰核-壳结构的PCL基复合支架，其中外壳层负载镁盐颗粒，内核层则含有钙类添加剂。通过调整内外层挤出速度，可以精确调控核-壳的几何比例。

研究得出以下核心结论：

1. 1.
   工艺可控性：同轴喷嘴能够稳定地产生化学组分截然不同的连续核-壳纤维，并且核壳尺寸可通过挤出速度进行线性调控。
2. 2.
   结构表征：纳米CT结合CellProfiler自动化图像分析，成功实现了对支架内部核区面积、镁颗粒形态（尺寸、球形度、表面积、体积）等关键参数的高通量、定量化表征。
3. 3.
   结构-性能关联：镁颗粒的形态计量学参数与挤出速度强相关。其中，C3条件（特定核/壳速度比）下的支架呈现出最大的镁颗粒直径、最低的球形度以及最高的表面积和体积，预示着最佳的早期镁离子释放潜力。
4. 4.
   释放动力学：基于菲克扩散理论建立的数学模型表明，核-壳结构相比均质纤维能显著缩短镁离子的释放时间，尤其是当核半径占总半径一半时，释放时间可缩短至均质纤维的约48.1%，这为实现早期爆发释放提供了理论依据。
5. 5.
   生物学性能：体外细胞毒性测试（符合ISO 10993-5标准）证实所有同轴支架均无细胞毒性。在直接接触实验中，C3支架表现出最优的细胞增殖活力。更重要的是，在无成骨诱导培养基的条件下，种植在C3支架上的人脂肪间充质干细胞（hADMSCs）在第二周即表现出骨涎蛋白（BSP）和骨桥蛋白（OPN）基因的显著上调，证明其具备自发促进早期成骨分化的能力。

这项研究的重大意义在于，它建立了一个从材料设计、制造、结构表征到性能预测的完整、可扩展的数据驱动工作流。该方法不仅揭示了同轴打印参数与最终支架功能之间的内在联系，也为未来理性设计和优化用于骨修复的多功能生物材料提供了强有力的工具。

主要关键技术方法

为开展此项研究，研究人员采用了以下几个关键技术方法：

1. 1.
   同轴颗粒挤出3D打印：使用定制的一步法同轴喷嘴和双单螺杆颗粒挤出机，将PCL、镁盐和磷酸三钙（TCP）等原料直接打印成具有核-壳结构的骨组织工程支架。
2. 2.
   纳米计算机断层扫描（nano-CT）：作为一种非破坏性的三维成像技术，用于高分辨率地表征支架的内部微观结构、核-壳完整性以及镁颗粒的空间分布和形态。
3. 3.
   基于CellProfiler的高通量自动图像分析：开发专用的分析流程，对海量的纳米CT切片图像进行批量处理，实现对核心区域面积、镁颗粒直径、球形度、表面积和体积等参数的快速、标准化定量。
4. 4.
   镁离子（Mg²⁺）释放动力学建模：利用从实验中获得的表观扩散系数，基于菲克扩散定律和贝塞尔函数解，建立数学模型，预测不同核-壳比例和纤维直径下镁离子的累积释放曲线。

研究结果详述

2.1. 同轴支架设计与制造过程

研究人员采用同轴喷嘴和两个单螺杆颗粒挤出机，成功制备了具有良好同心度和一致直径的连续核-壳纤维。通过在外壳中加入氧化铁（Fe₂O₃）颜料进行视觉验证，清晰地展示了白色PCL核心被棕色PCL-Fe₂O₃外壳均匀包裹的核-壳结构。

2.2. 支架几何结构与核-壳完整性验证

• •
  2.2.1. 氧化铁负载同轴生物材料的物理化学表征：光学显微镜显示，核壳尺寸随各自挤出速度线性变化，且具有良好的圆度和同心度（偏差小于5 μm）。动态力学分析（DMA）表明，随着核占比增加，储能模量升高。拉曼光谱和能谱分析（SEM-EDS）证实了核心区域仅有PCL，而外壳区域同时含有PCL和Fe₂O₃，证明了化学组分的分离。
• •
  2.2.2. 含镁盐和钙添加剂的多材料同轴构建体：在正式的多材料支架中，纳米CT清晰地显示了高密度的钙（Ca）集中在核心，而镁（Mg）颗粒主要分布在壳层。SEM-EDS进一步确认了这一分布模式。定量分析表明，较低的核挤出速度会减小核面积，而过高的核速则会导致截面椭圆化和稳定性下降。

2.3. 使用CellProfiler量化同轴生物材料中的核心区域

研究人员开发了CellProfiler自动化分析流程，对纳米CT切片进行高斯滤波、Otsu阈值分割和核心区域测量。结果表明，对于0.3 mm和0.4 mm两种喷嘴，核心面积百分比均随核挤出速度的增加而增加，但在超过C3条件后，由于核-壳流动失衡，核心面积的控制精度下降。

2.4. 镁盐颗粒的表征

纳米CT定量分析显示，从C1到C4条件，镁颗粒数量逐渐减少，这与壳层挤出速度降低一致。颗粒直径、表面积和体积从C1到C3呈增加趋势，而球形度则下降，这表明较低的壳层速度可能导致颗粒聚集。在C4条件下，这些参数又有所下降，归因于极度不平衡的核-壳流破坏了壳层的稳定传输。

2.5. 镁释放曲线

研究人员基于先前实验确定的Mg²⁺在PCL中的表观扩散系数（D₁和D₂），建立了数学模型来计算不同直径纤维的释放曲线。计算结果表明，释放时间与纤维直径的平方成正比。对于核-壳结构，释放时间会进一步缩短。例如，当核半径占总半径一半时，释放66%镁所需的时间仅为实心纤维的48.1%。这表明，通过调整核-壳比例可以有效调控Mg²⁺的早期爆发释放。

2.6. 体外生物学评价

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  2.6.1. 样品提取物的体外细胞毒性试验：所有同轴支架（C2, C3, C4）的浸提液均未对L929细胞产生毒性，细胞代谢活性高于70%的毒性阈值。
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  2.6.2. 直接接触法的体外细胞毒性试验：MC3T3细胞在所有支架表面均显示出随时间增长的代谢活性和DNA含量，表明支架具有良好的生物相容性。其中，C3支架表现出最高的细胞增殖率。Live/Dead染色也证实了C3支架上活细胞密度最高。
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  2.6.3. 成骨基因表达：将hADMSCs接种在C3支架（PCL/TCP核心-PCL/Mg壳）上，在无成骨诱导培养基条件下，其BSP和OPN基因在第2周即出现显著上调（分别为对照组的4倍和6倍），远早于对照组和均质PCL/TCP支架。这有力地证明了C3支架释放的Mg²⁺能够在无外源诱导因子下促进早期成骨分化。而在加入成骨诱导培养基后，该支架的成骨基因表达反而较低，研究人员推测可能是由于Mg²⁺与培养基中的β-甘油磷酸钠（β-GP）发生相互作用，导致局部Mg²⁺浓度过高或干扰了矿化过程。

总结讨论与研究结论

本研究的讨论部分指出，纳米CT衍生的形态计量学参数（如壳层厚度、颗粒形状各向异性）与Mg²⁺释放行为之间存在可预测的结构-性质关系。壳层厚度是控制释放的主导因素，符合菲克扩散理论（t₅₀ ∝ δ²）。C3支架因其最小的壳层厚度、最大的核心面积以及最有利于形成连通孔道的非球形镁颗粒形态，实现了最优的早期爆发释放和细胞生物学响应。研究强调，虽然可以预测结构参数对性能的影响，但多个参数会同步变化，因此将生物学响应归因于单一参数需谨慎，未来需要更多多变量分析。

研究结论：本研究成功展示了一种集成纳米CT、CellProfiler高通量图像分析和Mg²⁺释放研究的综合工作流程，用于评估同轴颗粒打印骨支架的结构-功能关系。通过一步法同轴打印，研究人员实现了镁盐颗粒在壳层中的可控空间分布。关键的形态计量学参数被量化，并与挤出速度和生物学性能相关联。体外实验证明，优化的同轴结构（C3条件）具有优异的生物相容性，并能通过早期Mg²⁺爆发释放有效促进hADMSCs的早期成骨分化。这项工作为理性设计和优化用于骨组织工程的多材料同轴生物材料提供了一个可扩展的、数据驱动的框架。