基于论文摘要，拟定以下专业标题： **肌源性融合素工程化脂质纳米颗粒增强骨骼肌mRNA递送**

《Advanced Functional Materials》：Myogenic Fusogen-Engineered Lipid Nanoparticles Enhance mRNA Delivery in Skeletal Muscle

　　

脂质纳米颗粒（LNPs）已成为mRNA疗法的强大载体，然而向骨骼肌的高效递送仍然具有挑战性。在本研究中，研究人员通过将肌肉特异性融合素Myomaker整合到LNP表面来工程化LNPs，以增强骨骼肌递送。优化后的Myomaker-LNP（Mymk-LNP）制剂显示出高融合素整合率、均匀的尺寸和高效的mRNA包封效率。Mymk-LNPs在分化的肌细胞中表现出选择性的体外转染，同时最小化成肌细胞和成纤维细胞中的摄取。Mymk-LNPs的体内全身性和局部给药显著增加了向骨骼肌的mRNA递送，特别是在肌肉正在经历融合的模型中，例如新生小鼠的发育中肌肉和成年小鼠的化学损伤肌肉。此外，Mymk-LNPs介导了损伤骨骼肌中高效的Cre mRNA介导的DNA重组，通过Cre依赖性tdTomato报告基因的激活进行量化。这些发现凸显了融合素工程化LNPs作为向肌肉递送mRNA疗法的靶向且有效平台的潜力。

**研究背景与现存问题**

基于mRNA的COVID-19疫苗成功之后，治疗性信使RNA（mRNA）策略为遗传性疾病、代谢疾病和癌症的精准、瞬时蛋白表达治疗带来了巨大希望。脂质纳米颗粒（Lipid nanoparticles，LNPs）已成为最有效的非病毒mRNA递送平台，具有高细胞摄取、高效内体逃逸和稳健转染效率等优势。然而，常规LNPs经全身给药后，主要因与血清蛋白（如载脂蛋白E，ApoE）的相互作用而蓄积于肝脏，严重限制了其对骨骼肌等肝外靶点的应用。骨骼肌是治疗遗传性疾病、代谢综合征和组织再生的关键靶器官。尽管病毒载体，特别是腺相关病毒（AAV），已广泛用于肌肉基因治疗，但其转基因承载能力有限、免疫原性高以及长期基因组整合风险给临床转化带来了重大挑战。近年来的LNP工程策略虽已实现向肺、脾、骨髓和脑等肝外组织的趋向性改良，但实现选择性且高效的骨骼肌mRNA递送仍是一大难题。因此，开发新型LNP制剂以增强肌肉特异性转染并减少脱靶效应，对于推进基于mRNA的肌肉疗法至关重要。

**研究目的与开展的工作**

骨骼肌具有独特的再生能力，依赖卫星细胞的融合来实现生长、修复和稳态维持。Myomaker是一种仅在肌原性细胞中表达的跨膜蛋白，通过介导细胞-细胞融合在这一过程中发挥基础性作用。受此前将Myomaker展示于慢病毒和病毒样颗粒表面的仿生设计策略启发，研究人员假设将全长Myomaker功能化修饰于LNP表面，可通过模拟天然成肌细胞融合过程，促进与肌纤维的靶向融合，从而增强细胞内mRNA摄取和翻译。基于此，本研究开发了Myomaker功能化LNPs（Mymk-LNPs）作为富集肌肉mRNA递送和Cre介导DNA重组的平台，并系统评估了其体外转染选择性、体内肌肉靶向能力及生物安全性。

**主要技术方法**

研究人员采用以下关键技术方法开展研究：利用杆状病毒系统在Sf9昆虫细胞中表达小鼠Myomaker蛋白，并经亲和纯化和凝胶过滤层析获得重组蛋白；采用后孵育表面修饰法将纯化的Myomaker蛋白整合到不同脂质配方的LNP表面，并系统优化蛋白与脂质的投料比；使用动态光散射（DLS）表征纳米颗粒的粒径、多分散系数（PDI）和Zeta电位；通过Western blot、免疫金标记透射电子显微镜（TEM）、冷冻电子显微镜（Cryo-EM）及双色免疫荧光染色验证Myomaker的整合效率、单颗粒分布、微观结构及膜拓扑取向；采用F?rster共振能量转移（FRET）试验评估Mymk-LNP与模拟质膜脂质体（PMMLs）的膜融合效率；在细胞水平上使用C2C12肌管、C2C12成肌细胞和10T?成纤维细胞评估转染效率与选择性；在动物水平上，选用新生小鼠（P2）及氯化钡（BaCl₂）诱导的成年小鼠肌肉损伤模型，通过面部静脉注射、尾静脉注射和肌肉内注射等途径评估体内递送效果，并利用Ai14报告小鼠评估Cre mRNA介导的DNA重组效率。

**研究结果**

**2.1 肌肉特异性融合素工程化LNPs的设计与表征**

研究人员配制了四种不同脂质组成的LNPs，并将Myomaker以5%蛋白-脂质重量比通过后孵育法整合至LNP表面。结果显示，含DOTAP的LNP 4具有最高的Myomaker整合效率（72.0%），显著高于其他配方。通过调控Myomaker投入量，在不显著影响粒径均一性（PDI < 0.3）的前提下实现了蛋白载量的梯度增加（61.7%至79.2%）。Western blot和免疫金标记证实Myomaker成功且特异性地整合于LNP表面。Cryo-EM显示Mymk-LNP 4呈均匀球形且具有清晰的外层脂质双分子层结构。双色免疫荧光染色证实Myomaker在LNP表面保持天然取向，即N端向外、C端朝向颗粒内部。稳定性研究表明，Mymk-LNP 4在PBS中4°C储存7天及50%小鼠血清37°C孵育24小时后，仍保持粒径稳定和Myomaker整合，表明具有良好的储存稳定性和血清稳定性。

**2.2 融合素工程化LNPs提高肌管的mRNA转染效率**

用DiD标记的Mymk-LNP 4与分化中的C2C12肌管共孵育后，细胞摄取显著高于非功能化LNPs。负载tdTomato mRNA后，Mymk-LNP 4在肌管中的tdTomato表达和转染效率显著优于非功能化LNP。以荧光素酶（Luc）mRNA为报告基因，Mymk-LNP 4在各测试剂量下的生物发光强度均显著高于金标准MC3-LNPs，也显著优于临床批准的SM102-LNPs制剂。值得注意的是，将Myomaker整合至SM102-LNPs后，其肌管转染效率提高了近三倍，表明该融合素功能化策略具有模块化适用性。

**2.3 融合素工程化LNPs提高mRNA递送至肌管的选择性**

在C2C12分化肌管、增殖成肌细胞和10T?成纤维细胞中比较转染效率，0.25%和1% Myomaker比例的Mymk-LNP 4在肌管中显著提高Luc蛋白表达，而在不表达Myomaker的成肌细胞和成纤维细胞中则无增强甚至有所降低，表现出对分化肌管的选择性转染。FRET膜融合试验显示，Mymk-LNP 4与PMMLs的膜融合效率较非功能化LNP 4提高近两倍，证实了Myomaker介导的膜融合机制。

**2.4 融合素工程化LNPs增强体内融合状态骨骼肌的mRNA递送**

在新生小鼠（P2期，肌肉发育活跃）中，经面部静脉注射Mymk-LNP 4后6小时，骨骼肌中Luc表达较对照组提高4.2倍，而主要器官的生物分布无显著差异。在BaCl₂诱导的成年小鼠肌肉损伤模型中，静脉注射和肌肉内注射Mymk-LNP 4均在损伤肌肉中产生显著强于对照组的Luc信号，而在未损伤肌肉中则无显著差异，表明Myomaker在再生肌肉融合过程中的富集递送作用。此外，肌内注射产生的Luc活性显著强于静脉注射，凸显了局部递送的优势。

**2.5 融合素工程化LNPs在再生骨骼肌中介导Cre重组**

在Ai14报告小鼠的BaCl₂损伤模型中，肌内注射负载Cre mRNA的Mymk-LNP 4后，tdTomato表达呈剂量依赖性增加。在1 mg/kg剂量下，Mymk-LNP 4组的TA肌肉转染效率达32.5%，显著高于非功能化LNP组（15.7%）和MC3-LNPs组（6.0%）。共聚焦成像确认了大量tdTomato阳性肌纤维的存在，且肝、肺等非靶器官中几乎无可检测的Cre介导重组，表明脱靶效应极低。

**2.6 融合素工程化LNPs的耐受性**

对经静脉和肌肉内注射Mymk-LNP 4的小鼠进行血清生化分析，ALT、AST、BUN和CREA水平与PBS对照组无显著差异；TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎细胞因子水平亦无显著升高。主要器官（心、肺、肝、脾、肾）的H&E染色组织学分析显示组织结构和免疫浸润与健康小鼠基本一致，证明Mymk-LNPs具有良好的生物相容性。

**总结与讨论**

本研究开发的Mymk-LNP平台通过模拟天然肌细胞融合过程，为肌肉特异性mRNA递送提供了一种不同于传统配体介导靶向的新策略。该平台在体外实现对Myomaker表达细胞的选择性转染，在体内三种肌肉融合活跃模型中均显著增强骨骼肌mRNA递送，且较临床批准的MC3-LNPs表现出更高的转染效率，并具有良好的安全性。研究结论指出，Mymk-LNP平台是概念验证性的融合素介导膜融合策略，为推进LNP介导的肌肉疾病基因治疗提供了新方向。未来研究可探索进一步修饰LNP配方，如引入融合微肽Myomixer或肌肉靶向肽，以及与现有肌肉靶向策略的系统比较，并在疾病模型（如杜氏肌营养不良症）中评估其治疗效力。