雌三醇对转染入COS-7细胞的人及象鲨雌激素受体α和雌激素受体β的转录激活作用强于17β-雌二醇或雌酮

《The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology》：Estriol is a Stronger Transcriptional Activator than is either 17β-Estradiol or Estrone of Human and Elephant Shark Estrogen Receptor-alpha and Estrogen Receptor-beta transfected into COS-7 Cells

　　

摘要

人类及其他脊椎动物含有两种雌激素受体（ERs），即ERα和ERβ，它们介导三种雌激素——雌酮（E1）、雌二醇（E2）和雌三醇（E3）的生理作用。在这三种雌激素中，在体内，E2是ERα和ERβ最强的转录激活剂，E1活性次之，E3最弱。我们研究了E2、E1和E3对非洲绿猴肾（COS-7）细胞中人类ERα和ERβ的转录激活作用，并与在人胚胎肾（HEK-293）细胞中雌激素刺激ER转录的研究进行了比较。令人惊讶的是，在COS-7细胞中，E3对人类ERα和ERβ的半数最大反应浓度（EC50）最低，E2为活性第二强的雌激素，E1居中。相反，对于转染到HEK-293细胞中的人类ERα和ERβ，E2是最活跃的雌激素，其次是E1和E3。在转染了象鲨ERα和ERβ的COS-7细胞和HEK-293细胞中也发现了类似的结果。因此，在某些条件下，E3是比E2或E1更活跃的雌激素。这表明E3可能是某些哺乳动物细胞中ER的一种新型生理配体。

引言

雌激素是一类在人类及其他脊椎动物女性和男性中具有多种生理活性的类固醇激素 [1], [2], [3], [4], [5]。雌激素通过与雌激素受体（ERs）结合来发挥作用 [5], [6]，雌激素受体属于核受体家族，这是一大类转录因子，包括孕激素、雄激素和糖皮质激素的受体 [7], [8], [9]。迄今为止，已在哺乳动物及其他脊椎动物中分离出两种不同的雌激素受体基因：雌激素受体alpha（ERα）和雌激素受体beta（ERβ）[10], [11], [12], [13]。人类ERα和ERβ在DNA结合域中具有很高的序列相似性（97%），但在配体结合域中仅有约55%的相似性。

在人类中，ERα表达于女性生殖组织（子宫、卵巢）、乳腺、肾脏和骨骼，而ERβ则表达于男性（前列腺）、卵巢、结肠、肾脏和免疫系统 [5], [14], [15]。有趣的是，ERs也在大脑中表达 [15], [16], [17], [18], [19], [20]。人类及其他脊椎动物的ERα和ERβ对17β-雌二醇（E2）——主要生理雌激素——以及对雌酮（E1，在人类中用作绝经后雌激素）和雌三醇（E3，由灵长类动物的胎盘合成）（图1）的应答已被广泛研究 [5], [6], [10], [23], [24]。

ERα和ERβ通过与雌激素结合而被激活，雌激素诱导ER构象变化，促进激素-受体复合物与特定DNA序列结合，从而启动雌激素依赖性基因转录。ERα促进组织增殖，而ERβ可能作为ERα介导增殖的抑制因子 [7], [25], [26]。

为了研究脊椎动物中雌激素信号的进化，我们将象鲨（Callorhinchus milii）的三种ERα亚型ERα1、ERα2、ERα3和ERβ与人类ERα和ERβ在HEK-293细胞中的转录激活作用进行了比较 [27]。由于象鲨ERs在HEK-293细胞中转录激活水平较低 [27]，即使使用高浓度E2也是如此，我们决定在猴肾（COS-7）细胞中重复C. milii ERα和ERβ的实验，因为COS-7细胞对外源引入的人工基因具有较高的应答水平 [28]。与我们在HEK-293细胞中的结果 [27] 不同，如本文所报告，我们发现转染到COS-7细胞中的象鲨ERα和ERβ，E3的EC50比E2或E1更低。为了确定E3的这种新型活性是否在人ERs中保守，我们比较了E1、E2和E3在COS-7细胞和HEK-293细胞中对人ERα和ERβ的激活作用。在此我们报告，E1、E2或E3对转染到COS-7细胞中的人ERα和ERβ的转录激活作用显示，E3对人ERα和ERβ的EC50比E2或E1对这些ER的EC50更低。这与使用HEK-293细胞的人ERα和ERβ研究结果形成对比，后者显示E2对人ERα和ERβ的EC50比E1或E3对这些ER的EC50更低 [27]。与E2相比，E3对转染到COS-7细胞中的人ERα和ERβ具有较低的EC50，提示E3可能在胎儿组织中具有尚未表征的生理活性，因为胎儿组织暴露于含有高浓度E3的羊水中 [24], [29]。

章节摘要

化学试剂

雌酮（E1）、雌二醇（E2）和雌三醇（E3）购自Sigma-Aldrich Corp.（密苏里州圣路易斯）。所有化学品均溶解于二甲基亚砜（DMSO）中。培养基中DMSO的浓度不超过0.1%。

质粒载体的构建

象鲨ERs和人类ERs已在之前的研究中描述过 [27], [30]。人类（ERα为M12674，ERβ为NM_001437）和象鲨（ERα1为LC068847，ERα2为XM_007894403，ERα3为XM_007894404，ERβ为LC068848）全长雌激素受体序列，

象鲨和人类ERα1和ERβ在HEK-293细胞和COS-7细胞中的转录激活

正如之前报道的 [27]，象鲨的雌激素受体（ER）在HEK-293细胞中对雌二醇（E2）表现出高度敏感性，这一特性与其他物种的雌激素受体一致 [7], [27], [31], [32], [33]。然而，E2在HEK-293细胞中激活ER的低倍激活值限制了其评估各种化学品效果的实用性。因此，我们研究了一种利用替代细胞类型的检测方法。我们决定

讨论

软骨鱼纲（有颌软骨鱼类）中的雌激素受体是肉鳍鱼类的基类，也是陆生脊椎动物的祖先 [35]。与人类不同，象鲨是卵生动物。通过对象鲨进行测序鉴定出三种雌激素激活的ERα亚型——ERα1、ERα2和ERα3——以及ERβ [35]，这为我们研究一种进化于约4.25亿年前的基类无颌脊椎动物中的雌激素信号通路提供了机会。为此，我们

未引用参考文献

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资金来源

本研究由日本文部科学省科学研究补助金（26K09381）资助给Y.K.，以及田中科学基金会资助给Y.K.

CRediT作者贡献声明

Baker Michael Edward：写作——审阅与编辑、写作——初稿撰写、验证、监督、项目管理、概念构思。Yoshinao Katsu：写作——审阅与编辑、写作——初稿撰写、可视化、验证、监督、项目管理、方法论、调查、资金获取、形式化分析、概念构思。Ronn Matthew delos Reyes Cabizares：写作——审阅与编辑、写作——初稿撰写、调查、形式化分析、数据管理。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。

致谢

我们衷心感谢明尼苏达州立大学曼卡托分校的Lina C. Wang博士对本

手稿的仔细审读。我们还感谢John Katzenellenbogen博士的宝贵意见，这些意见改进了我们的手稿。我们感谢实验室同事对本研究的支持。

Ya Ao|Ronn Matthew delos Reyes Cabizares|Michael E. Baker|Yoshinao Katsu

北海道大学大学院生命科学院，日本札幌 060-0810