溶液中HIV-1 gag多聚蛋白的结构

《Journal of Structural Biology》：Structure of the HIV-1 gag polyprotein in solution

　　

• 通过SAXS确定了溶液中HIV-1 Gag-?p6的结构。
• 在低浓度下，Gag-?p6在溶液中以单体形式存在；在高浓度下则形成三聚体。
• 未观察到高于三聚体的寡聚体。
• Gag-?p6三聚体是新病毒颗粒形成的关键要素，这可从MD模拟和AlphaFold3模拟中得出。

引言
1型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）仍是全球范围内严重的公共卫生问题。HIV-1中最具代表性的55 kDa群特异性抗原Gag多蛋白是病毒最关键的组分之一，直接负责从被有效感染的细胞中形成新的病毒颗粒（Bell和Lever，2013）。从N端到C端，Gag由基质蛋白域（MA）、衣壳蛋白域（CA）、核衣壳蛋白域（NC）和p6域组成，以及间隔肽SP1（p2）和SP2（p1）（Ferguson等，2002）。新病毒颗粒的形成是通过Gag多蛋白与质膜（PM）内表面的结合、通过各蛋白结构域之间的特定相互作用发生多聚化，以及病毒颗粒从宿主细胞出芽的过程来实现的（Zhou等，2023；Socas和Ambroggio，2023）。

Gag多蛋白具有根据环境的物理化学参数自组装的能力，即使在没有其他病毒组分的情况下也是如此。该领域的经典工作出自Stephen Campbell和Alan Rein（Campbell和Rein，1999），作者在其中详细描述了全长重组Gag以及缺乏C端p6域的Gag（Gag-Δp6）在细胞中自组装的条件。p6域的缺失或存在并不影响自组装的结果，因此在一系列后续实验中仅使用了Gag-Δp6蛋白。最重要的事实是，电子显微镜显示，Gag-Δp6多聚化为二聚体以上单元以及形成25–30 nm直径的规则球形颗粒需要RNA的存在。后来发现，Gag组装成直径为100–150 nm的正确颗粒、模拟未成熟病毒结构的起始，是通过添加肌醇磷酸来实现的（Campbell等，2001；Dick等，2018）。因此，要形成基于Gag的类病毒颗粒（VLP），反应介质中RNA和肌醇磷酸的存在是必要且充分的。

Gag多蛋白由几个通过柔性连接区相连的功能结构域组成，这一特点使得单个蛋白质大分子的结构研究变得复杂。其巨大的尺寸和存在无序区域使得经典的X射线晶体学难以进行。正因如此，Gag多蛋白无法结晶，也没有高分辨率结构。与此同时，所有主要Gag功能结构域（亚基）的特性已被充分研究。最近的综述（Marie和Gordon，2022）对HIV-1 Gag各结构域在病毒颗粒完整性、功能性和感染性中的结构和功能作用进行了全面总结。单个蛋白结构域的高分辨率结构已被确定，例如：MA（PDB编号：2H3I，1HIW，2HMX，7E1I）、CA（PDB编号：6WAP，3NTE，4XFX，3J3Q）、SP1（PDB编号：1U57）、NC（PDB编号：1ESK）。此外可参见官方UniProt网站（https://www.uniprot.org/uniprot/P04591），该网站提供了众多HIV-1 Gag单个结构域的高分辨率结构。

多蛋白关键结构域之间的相互作用及其寡聚化条件也在被积极研究（Ganser-Pornillos等，2008；Freed，2015；Monje-Galvan和Voth，2020）。已知MA结构域以三聚体形式结晶（Hill等，1996），并在含有磷脂酰肌醇-(4,5)-二磷酸（PI[4,5]P2）的膜上以六聚体（三聚体的二聚体）形式自组装（Alfadhli等，2009）。随后，在HIV-1成熟过程中，PI[4,5]P2从膜上释放并结合并MA上的口袋，重新排列膜结合的MA晶格并调节脂质双分子层本身（Qu等，2021）。因此，可以得出结论，MA在病毒颗粒的成熟过程中发挥重要的功能作用，也许正是MA完全决定了HIV-1自组装启动前Gag多蛋白的寡聚化过程。然而，也有研究表明，尽管MA结合到膜上，但在未成熟病毒颗粒中并不形成连续的规则晶格（Briggs等，2006），而且令人非常惊讶的是，即使在缺乏病毒基质蛋白的情况下，高效的病毒复制也可以发生（Reil等，1998）。

HIV-1衣壳由Gag多蛋白的CA亚基组装成一个类似富勒烯的锥形衣壳，该衣壳由大约250个CA六聚体和12个CA五聚体组成，在病毒生命周期中为病毒RNA提供保护外壳（Ganser-Pornillos等，2004；Wright等，2007；Pornillos等，2011）。单个CA亚基由两个亚域组成：一个约150个氨基酸长度的N端结构域（CANTD）和一个约80个氨基酸的C端结构域（CACTD），两者通过柔性连接区相连。单个HIV-1 CA结构域的高分辨率原子结构已通过X射线晶体学确定（Ivanov等，2007；Kelly等，2006）。重要的是，单独的HIV-1 CA亚基已被证明可在溶液中二聚化，且二聚化依赖于CACTD残基Trp184和Met185（Gamble等，1997）。另一方面，研究发现Gag的MA结构域和MA-CA片段在溶液中均形成三聚体，而单独的CA在相似条件下呈单体状态（Morikawa等，1998）。

在HIV-1组装过程中，未成熟病毒颗粒中Gag-Gag之间的关键接触也由CA的C端结构域和相邻的SP1间隔肽参与形成（Ganser-Pornillos等，2008；Wright等，2007）。CACTD-SP1区域在多蛋白Gag链中位于远离MA结构域的位置，但最近的研究表明该区域可与质膜相互作用（Denieva等，2024）。该区域的重要性此前已通过SP1内的突变得到验证，这些突变严重削弱了Gag与细胞膜结合的能力，并在膜上导致含有未加工Gag的管状结构的形成（Guo等，2005；Datta等，2011a）。

所有这些事实都应在构建Gag多蛋白及其可能寡聚体的结构模型时予以考虑。研究Gag寡聚化过程的真正挑战在于理解多蛋白的不同结构域在寡聚化过程中将如何相互作，同时由于它们被连接成单一蛋白链而限制了运动能力。此外，为了更好地理解Gag多蛋白的功能能力，有必要研究其在接近天然条件下其灵活性、相应构象和寡聚化程度。解决这些问题最有效的
方法之一是广角X射线散射（SAXS）（Svergun等，2013）。重要的是，利用S
AXS数据重建蛋白质大分子的三维模型面临着歧义性问题，因为从一维小角散射谱重建三维结构属于反问题求解。然而，通过独立结构技术的平行研究，贡献互补的结构信息，可以对复杂生物系统进行综合表征，并排除各方法数据解释可能的歧义。在无法使用互补方法的情况下，应用多种独立的基于SAXS的方法来获得可靠的结构数据和模型（Manalastas-Cantos等，2021）。

尽管小角散射方法近期取得了进展，但文献中仅有少数研究致力于使用X射线衍射（SAXS）和中子散射（SANS）对溶液中Gag-Δp6进行结构表征。溶液中Gag-Δp6的整体形状、尺寸、小角散射不变量（回转半径、距离分布函数等），以及Gag-Δp6蛋白在溶液中的去折叠程度和柔性已被测定（Datta等，2007a；Datta等，2011b）。已有的Gag-Δp6各结构域高分辨率结构被用于建模其三维结构（Datta等，2011c），而多蛋白大分子的柔性则通过分子动力学进行评估，将所得模型的
理论散射拟合到实验SAXS曲线（Qualley等，2019）。因此，研究表明，单体Gag-Δp6蛋白在溶液中具有相对紧凑但柔性的形状。据推测，由于Gag在组装的未成熟病毒颗粒中呈刚性棒状，Gag多蛋白在自组装过程中会发生显著构象变化（Datta等，2007a）。此外，研究还表明，在无核酸的情况下，Gag-Δp6在溶液中以单体-二聚体平衡形式存在，而肌醇磷酸的存在将动态平衡偏向单体-三聚体（Datta等，2007b）。CA和NC结构域之间的SP1间隔肽对病毒颗粒组装的影响也利用小角散射进行了研究（Datta等，2016）。

需要强调的是，所有利用小角技术对溶液中Gag结构的研究都聚焦于多蛋白单体或其各个片段的相互作用和寡聚化。全长Gag或Gag-Δp6寡聚体形式的结构仍然未知。因此，本工作的目的是利用广角X射线散射结合AlphaFold3人工智能系统和分子动力学（MD）等现代结构方法，在两种不同浓度下研究溶液中Gag多蛋白的结构特征和行为。我们使用了重组非豆蔻酰化的Gag-?p6，这是传统上用于研究Gag组装过程的蛋白（Campbell和Rein，1999）。结果表明，Gag-?p6在溶液中仅形成三聚体，在浓度高达8 mg/ml时未检测到更高阶寡聚体。Gag的寡聚化导致形成由三个MA、至少两个CA和两个SP1结构域组成的致密核心，用于与膜接触。

章节片段
Gag多蛋白的分离与纯化
重组HIV-1 Gag-?p6在E. coli BL21（DE3）pLysS中表达后纯化，细菌培养物在37 °C条件下培养4小时，使用0.4 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷诱导，此前已有详细描述（Datta和Rein，2009）。用0.1%（重量比）聚乙二亚胺处理细胞裂解液以去除核酸，然后用硫酸铵分级（至30%饱和度）。富含Gag多蛋白的沉淀物通过亲和层析使用琼脂糖柱进行纯化，使用……

溶液中Gag的总体特征
首先对浓度为2和8 mg/ml下溶液中缺乏p6域的重组非豆蔻酰化Gag（Gag-?p6）的总体特征进行了评估，以了解多蛋白的寡聚状态以及是否存在聚集体，因为聚集体的存在会极大地增加利用小角散射解决结构问题的难度。图1展示了Gag-?p6在三种不同浓度下溶液中的实验小角散射曲线。

图1
CRediT作者贡献声明
E.V. Shtykova：撰写初稿、可视化、方法学、调查、形式分析、数据整理、概念化。
M.V. Petoukhov：调查、形式分析、数据整理。
L.A. Dadinova：调查、数据整理、概念化。
Z.G. Denieva：撰写——审阅与编辑、形式分析、数据整理。
O.V. Batishchev：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、经费获取、形式分析、数据整理。

资助
本研究由俄罗斯联邦科学与高等教育部提供资金支持。

利益冲突声明
作者声明不存在任何已知的影响本论文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢
作者感谢A.M. Gordienko提供的卓越技术协助。

E.V. Shtykova | M.V. Petoukhov | L.A. Dadinova | Z.G. Denieva | O.V. Batishchev