一种几何引导的计算框架，用于预测植物过氧化物酶在化学修饰表面上的功能性固定化取向

《Journal of Molecular Graphics and Modelling》：A geometry-guided computational framework for predicting functional immobilization orientations of plant peroxidases on chemically modified surfaces

　　

• 几何引导框架可预测酶的功能性固定化取向。 • 羟基化表面为所有过氧化物酶提供了最有利的取向。 • 残基水平排名可识别酶特异性的锚定位点。 • 催化可及性与表面化学特性被联合评估。 • 该工作流程可在实验测试前实现理性固定化。 引言 酶在相对温和的反应条件下具有高的催化效率和选择性，这使得它们在生物催化、分析化学、环境修复、食品处理以及生物传感器开发中具有吸引力 [[1], [2], [3], [4]]。然而，它们的实际应用经常受到操作稳定性不足、难以从反应介质中回收以及在重复使用过程中活性下降的限制。在固体载体上的固定化可以缓解其中一些限制，通过促进催化剂分离、提高可重复使用性，并在适当条件下增强对温度、溶剂或极端pH值的抵抗力 [[1], [2], [3]]。然而，固定化并不天然地改善酶的性能。固定化生物催化剂的最终性质取决于结合机制、载体的物理化学特性、结合点的数量和位置，以及蛋白质接触表面后的结构响应 [[2], [3], [4], [5], [6]]。共价固定化被广泛使用，因为它提供了强的结合力并最大限度地减少了操作过程中的酶泄漏 [2,3]。表面羧基、氨基、羟基、醛基、环氧基和马来酰亚胺基团可以直接参与或间接参与涉及可及氨基酸侧链的偶联反应 [3,[5], [6], [7]]。赖氨酸残基尤其相关，因为它们的氨基在许多蛋白质表面上都很丰富，可以与含活化的羧基或羟基的材料发生反应。然而，通过多个赖氨酸残基进行偶联可以产生异质性酶群体，分子通过不同区域结合并相对于载体采用不同的取向 [5,8]。即使使用相同的酶、载体和化学反应，这些取向在催化能力方面也可能存在显著差异。 因此，蛋白质取向是酶固定化中一个基本但通常控制不足的变量 [[8], [9], [10], [11], [12]]。暴露催化入口到周围溶液的取向可能保留底物扩散和产物释放。相反，靠近活性位的结合可能部分或完全阻碍催化通道。与载体的广泛接触也可能促进构象限制、扰动局部水化或产生不利的静电相互作用 [[9], [10], [11], [12], [13]]。使用位点特异性结合的实验研究表明，改变单一的系留位置可以改变酶的取向、催化活性、表面覆盖率和稳定性 [10,11,14]。对于枯草杆菌蛋白酶，通过故意引入位于远离催化区域的半胱氨酸进行固定化，产生了更易及的活性位和更高的催化效率，优于传统的随机结合 [14]。关于硝基还原酶的类似研究证明，通过不同的表面位置结合可以产生分子取向和生物活性的可测量变化 [11,15]。这些发现表明，固定化位点应被视为设计变量，而非偶联化学的附带结果。支撑表面的化学提供了额外的控制水平。带电和极性官能团通过静电相互作用、氢键、水化和局部去溶剂化影响蛋白质接近 [9,10,16]。因此，两个具有可比反应性基团密度的表面可能产生不同的取向分布。一项关于表面系留β-半乳糖苷酶的计算和光谱研究表明，增加载体亲水性降低了表面覆盖率但改善了催化活性，该效应与较弱的非特异性蛋白质-表面相互作用和更有利的酶构象有关 [10]。计算静电模型也证明，蛋白质的电荷分布和表面产生的电场可以决定优先吸附取向 [9]。因此，表面相容性必须与锚定几何形状一起评估，因为化学活性表面不一定是最能保持催化可及性的表面。 辣根过氧化物酶（HRP）一直是研究这些效应的重要模型。对固定在聚(2-羟基乙基甲基丙烯酸酯)刷上的HRP进行分子建模，鉴定出Lys232和Lys241为可能的结合位点，可以保持催化口袋的暴露 [16]。尽管预测的几何构型有利，但实验测量显示催化周转率显著降低，表明仅取向无法解释固定化酶的完全响应。二级相互作用、偶联约束和局部结构变化被提出作为附加因素 [16]。其他研究报告称，共价结合比非特异性吸附更能有效保持辣根过氧化物酶结构，同时产生更高的表面活性 [17]。固定化辣根过氧化物酶的分子单层也已被用于电化学和光学系统中，证明了控制固体界面上酶的负载、分布和可及性的重要性 [[18], [19], [20]]。 植物第三类过氧化物酶是研究取向依赖性固定化的合适体系，因为它们共享保守的含血红素折叠，但在表面组成、稳定性、糖基化和底物进入结构方面表现出差异 [[21], [22], [23], [24]]。这些酶利用过氧化氢催化多种有机和无机底物的氧化反应，已被探索用于生物传感、污染物转化、合成化学和诊断应用 [21,25]。来源于Armoracia rusticana的HRP是该类中表征最广泛的成员。其晶体结构揭示了隐藏的血红素基团，通过定义的底物进入区域与溶剂相连，其几何形状受到F和G螺旋之间特征性插入的影响 [22]。由于催化周转需要进入该区域，在通道入口附近进行固定化可能对观察到的活性产生特别强的影响。 来源于Glycine max的大豆种皮过氧化物酶（SBP）共享一般的第三类过氧化物酶架构，但表现出异常的稳定性以及血红素基团与周围蛋白基质之间的独特相互作用 [23]。从Roystonea regia中分离的帝王棕树过氧化物酶（RPTP）也以其对温度、酸性条件、过氧化氢和有机溶剂的高稳定性而著称 [24,26]。其结构包含广泛的糖基化，并保留了分泌型植物过氧化物酶的特征性血红素和钙含量组织 [24]。HRP、SBP和RPTP实验三维结构的可获得性提供了研究结构相关酶是否产生相似或酶特异性的固定化景观的机会。 尽管对酶固定化进行了广泛的实验研究，但计算预测仍然通常局限于单个体系、有限数量的结合残基，或者当必须筛选许多酶和载体组合时可能成本高昂的详细分子模拟 [9,10,15,16]。完整的分子动力学模拟提供了关于构象适应和界面相互作用的有价值信息，但其计算成本可能限制对众多取向、锚定位点和表面化学的系统探索。相反，对单一结合姿态的纯几何检查可能忽略竞争的取向，并且可能无法区分高分的孤立构型与广泛有利的取向集合。因此，一种实用的筛选方法应将结构可及性、催化通道暴露、锚定可行性、空间相容性和简化的表面化学描述符整合在一起，同时保持足够的可解释性以指导实验决策。 在本研究中，我们开发了一种由分子几何引导的计算框架，用于筛选植物过氧化物酶在平面化学修饰表面上的功能性固定化取向。HRP、SBP和RPTP被用作案例研究。从实验结构中鉴定表面暴露的候选锚定残基，并应用系统的刚体采样生成替代的酶取向。使用功能性取向评分评估构型，该评分考虑了血红素可及性、催化通道暴露、锚定接近度、酶-表面分离度和空间可行性。然后使用化学和静电相容性描述符比较了羧酸化、羟基化和胺化表面模型。还检查了敏感性、评分离散度、取向鲁棒性和反应性残基可及性。所得工作流程旨在作为一种可解释的筛选策略，用于在实验固定化之前对酶、表面和锚定组合进行优先级排序。完整的计算策略，包括结构准备、取向采样、表面化学评估、鲁棒性分析和残基排名，总结在Scheme 1中。 章节片段 计算工作流程和结构准备 开发了一种计算工作流程来评估辣根过氧化物酶（HRP）、大豆过氧化物酶（SBP）和帝王棕树过氧化物酶（RPTP）在化学修饰平面表面上的固定化取向。该程序包括结构准备、候选锚定残基的鉴定、刚体取向采样、功能性描述符计算、表面化学的纳入以及鲁棒性分析，总结在Scheme 1中。晶体结构为 功能性取向景观的HRP、SBP和RPTP 系统的刚体采样为HRP生成了1368个初始取向，为SBP生成了1368个，为RPTP生成了1560个。在应用空间可行性判据后，三种酶之间观察到明显差异。SBP保留了1248个可行构型，对应于采样取向的91.23%，而RPTP保留了1128个可行构型，对应于72.31%。HRP显示出最受限的取向景观，仅有480个可行构型，相当于 结论 本研究提出了一种几何引导的计算框架，用于通过整合取向采样、催化可及性、表面化学和残基水平结构性质来预测植物过氧化物酶的功能性有利固定化取向。对HRP、SBP和RPTP的应用表明，具有相似整体折叠的酶可能由于表面组成和取向景观的差异而需要不同的固定化策略。羟基化 关于写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明 在准备本工作期间，作者使用了由OpenAI开发的ChatGPT来辅助语言精炼、组织和稿件编辑修订。作者随后审查和编辑了所有生成内容，并对出版物的科学准确性、解释和最终内容承担全部责任。 利益冲突声明 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：John J. Castillo报告了由桑坦德工业大学提供。John J. Castillo报告了与桑坦德工业大学的关系，包括：就业。如果有其他作者，他们声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响所报告的工作。 致谢 作者衷心感谢桑坦德工业大学和研究扩展副校长办公室通过UIS内部研究征集项目2714提供的机构支持。 John J. Castillo