整合对接与分子动力学模拟鉴定AKT1潜在别构调节剂

《Journal of Molecular Graphics and Modelling》：Integrative docking and molecular dynamics identify potential allosteric modulators of AKT1

　　

•基于结构的虚拟筛选从14,043种化合物中识别出两种潜在AKT1调节剂。
•命中化合物展现出优于MK-2206、Bay 1125976和Inhibitor VIII的XP对接评分。
•化合物1和2与关键变构残基Trp80和Tyr272维持了持续接触。
•PCA、DCCM和FEL共同证明化合物1和2具有增强的构象稳定性。
•三种候选物均满足类药性特征，预测口服吸收率超过80%，且具有较低的hERG风险。

引言

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌病例的大多数[1]。NSCLC的进展由多种因素复杂互作驱动，包括致癌信号失调、免疫逃逸和氧化应激，这些因素共同破坏基本细胞过程，促进失控的增殖、侵袭和转移[[2]，[3]，[4]]。在涉及NSCLC发病机制的分子驱动因素中，多种生长因子和受体，如RAS、表皮生长因子受体（EGFR）和人表皮生长因子受体2（Her2/Neu），要么发生直接突变，要么异常过表达，成为疾病进展的关键决定因素[5,6]。越来越多的证据强调了EGFR——一种跨膜受体酪氨酸激酶，主导增殖、凋亡、血管生成和肿瘤生长——在NSCLC中作为主要治疗靶点的重要性。然而，携带多种EGFR突变的患者常常对第一代和第二代EGFR靶向药物产生耐药性，这凸显了单一靶点治疗策略的固有局限性，以及识别替代和互补分子靶点的迫切需求[7]。

下游级联反应包括丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MAPK/ERK）、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）和Janus激酶/信号转导与转录激活因子（JAK/STAT）通路。其中，PI3K/AKT通路已成为NSCLC中最常失调的信号网络之一[8]。AKT是PI3K/AKT/mTOR信号级联中的一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是下游信号传导的核心调节因子。AKT通路的过度激活已在多种NSCLC细胞系[9,10]及30%-75%的NSCLC中[[11]，[12]，[13]，[14]，[15]]被报道，其在促进化疗和放疗耐药中发挥作用[9]。在意大利NSCLC队列中，AKT在Ser473的磷酸化在高级别肿瘤（3-4级）中比低级别（1-2级）中更为常见，且在晚期疾病中比早期更为普遍[16]，从而确立了AKT激活作为疾病侵袭性和不良预后标志物的地位。从机制上讲，异常的AKT激活改变了多个下游通路：mTORC1通路的激活促进肿瘤细胞生长、转移和侵袭；GSK3β的抑制诱导β-连环蛋白的核积累以及促增殖和上皮-间充质转化（EMT）相关蛋白的转录上调，包括Cyclin D1、c-Myc和Snail；核心促凋亡分子（包括BAD、FOXO转录因子和p53）的磷酸化抑制了凋亡信号传导，赋予肿瘤细胞生存优势[[17]，[18]，[19]，[20]]。

虽然泛AKT抑制在克服化疗耐药方面展现了临床前疗效，但单个AKT亚型对NSCLC病理生理学的功能贡献仍未完全阐明。然而，先前的研究表明，选择性靶向AKT1——AKT激酶家族的关键成员——对于NSCLC的管理而言是一项特别有前景且具有治疗优势的策略。AKT1的沉默已被证明能增强顺铂诱导的A459和H460 NSCLC细胞的凋亡性死亡，直接将AKT1与促进肿瘤细胞存活联系起来[21]。此外，推测的AKT1抑制剂A-674563在NSCLC细胞增殖中表现出比泛AKT抑制剂MK-2206更强的抗增殖效果，表明亚型选择性AKT1抑制比广谱AKT抑制引发更强烈和更集中的抗肿瘤反应[22]。AKT1抑制还被证明能将细胞周期阻滞在G2/M期，进一步证实其作为NSCLC中细胞周期调控靶点的治疗相关性[22]。总之，这些观察结果凸显了亚型选择性AKT1靶向相较于泛AKT1抑制的潜在治疗优势，并为开发AKT1优先变构配体提供了令人信服的理由。

在NSCLC中专门追求变构AKT1抑制的理由基于三个考量。首先，该疾病对该通路的依赖性近乎普遍：超过90%的NSCLC细胞系中报道了AKT的组成性激活，其对PI3K抑制和辐射耐药均有所贡献，且AKT1扩增已被确定为肺癌细胞中顺铂耐药的原因[9,23]。其次，也是最直接的策略考量——本文采用的策略——AKT1在肺癌中的反复致癌病变位于PH结构域本身。E17K替代突变在约0.6-2%的NSCLC中被报道，在鳞状组织学类型和吸烟者中富集，增加了AKT1对磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸的亲和力，从而驱动组成性膜募集和激活[24]。关键在于，该突变已被证明改变了变构激酶抑制的敏感性，而对ATP竞争性抑制剂的敏感性保持不变[25]。由于本工作中靶向的变构口袋由PH结构域与激酶结构域的界面形成，变构机制与肺癌相关激活突变所在的结构域存在机制性耦联，这是ATP竞争性抑制所不具备的。这种关系为该策略提供了特定的结构合理性，而非泛泛的变构靶向偏好。第三，治疗缺口在鳞状细胞癌中最为迫切——这是NSCLC的第二大常见形式，其中激活型EGFR突变通常缺失，EGFR靶向治疗相应地无效，而PIK3CA和AKT1改变则相对富集[26]。另一个考量有利于亚型选择性而非泛AKT抑制用于NSCLC的长期给药。泛AKT抑制剂的剂量限制性毒性是高血糖，在20-24%接受卡匹塞替尼的患者中被报道，足以中止GSK690693的临床开发，这种毒性主要归因于对AKT2的抑制，AKT2在外周组织胰岛素刺激的葡萄糖摄取中发挥着不可替代的作用[27]。

多种AKT抑制剂已进入临床评估，反映了PI3K/AKT/mTOR通路作为癌症药物靶点日益增长的认可度。卡匹塞替尼，一种口服泛AKT抑制剂，已与化疗或激素药物联合推进至I期和II期试验。伊帕他替尼已推进至激素受体阳性（HR+）和三阴性乳腺癌的III期评估。变构泛AKT抑制剂MK-2206也已推进至III期临床评估。然而，脱靶效应，包括毒性和不良反应，凸显了对新型亚型选择性AKT1抑制剂的需求。变构抑制靶向AKT1非活性构象中独特的PH-激酶结构域界面，而非跨更广泛激酶超家族高度保守的ATP结合口袋，提供了一种机制上独特且潜在更具选择性的抑制策略，在最大化亚型特异性的同时最小化脱靶效应风险。

在本研究中，我们旨在通过应用全面的多阶段基于结构的虚拟筛选流程来解决这一未满足的需求。据我们所知，这是首个针对AKT1变构位点筛选ChemDiv AKT靶向库中14,043种小分子的研究。采用HTVS、SP、XP对接协议的层级虚拟筛选，结合MM-GBSA结合计算和药代动力学特征分析，鉴定出三种具有不同化学骨架的排名靠前的化合物，并进行300 ns分子动力学模拟以评估生理条件下蛋白-配体结合稳定性和构象动态。本研究的成果为理解所鉴定化合物的变构结合潜力提供了全面的机制框架，并为NSCLC治疗中高选择性和高活性AKT抑制剂的合理设计和优化提供了有价值的结构见解。

片段部分

蛋白质准备与网格生成

从RCSB蛋白质数据库检索人类AKT1的三维（3D）晶体结构（PDB ID: 3O96；分辨率：2.70 ?；R值：0.308），代表A链并包含446个氨基酸，作为虚拟筛选的分子靶点[28]。选择该结构是因为它捕获了自抑制PH-in构象，其中PH结构域与激酶结构域的界面形成了变构口袋；该口袋在非自抑制构象中不存在。

AKT1的总体架构与机制

AKT结构提供了其重要结构域和功能的见解。AKT是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在细胞存活、增殖和代谢中发挥核心作用。它存在三种亚型：AKT1、AKT2和AKT3[37]，各自由不同的基因编码，但共享高度保守的结构架构。AKT由三个保守的结构域组成：N端PH结构域（PH）、中央激酶结构域和灵活的C端调节结构域。

讨论

NSCLC仍然是最具挑战性的治疗难题之一，因为其深刻的分子异质性和获得药物耐药性的深层固有倾向。虽然奥希替尼和阿来替尼等下一代靶向治疗分别在携带EGFR和ALK定义明确的致癌驱动突变的肿瘤中展现了显著临床疗效，但这些药物的治疗效用固有地限于携带此类突变的有限患者亚群。

作者贡献声明

Raju Das：写作—原始草稿、可视化、验证、资源、方法论、调查、形式分析、数据管理、概念化。Armin Sultana：写作—原始草稿、可视化、验证、方法论、调查、形式分析、数据管理。Kantu Das：写作—原始草稿、可视化、验证、资源、方法论、调查、形式分析、数据管理。Dipannita Chowdhury：可视化、验证、方法论、形式分析。

生成式AI使用声明

作者确认在撰写、编辑或准备本手稿中的任何内容时未使用生成式AI工具。

财务披露

本研究由韩国国家研究基金会资助，资助编号：RS-2023-00247033。资助方在研究设计、数据收集和分析、出版决策以及手稿准备中均无参与角色。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。

Raju Das | Armin Sultana | Kantu Das | Dipannita Chowdhury | Seong Woo Choi | Joohan Woo