《Journal of Chromatography A》：Robust ultra-trace quantification of multi-class antibiotics in environmental waters using automated 96-well SPE and LC–HRMS
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抗生素是人和动物医学中应用最广泛的药物类别之一。过去几十年来，全球抗生素消费量持续上升。尽管抗生素在治疗细菌感染方面挽救了数百万人的生命，但其广泛且往往不加选择的使用引发了严重的环境和公共卫生担忧。特别是，抗生素耐药性的加速出现和传播对全球健康构成重大威胁。相
抗生素是人和动物医学中应用最广泛的药物类别之一。过去几十年来，全球抗生素消费量持续上升。尽管抗生素在治疗细菌感染方面挽救了数百万人的生命，但其广泛且往往不加选择的使用引发了严重的环境和公共卫生担忧。特别是，抗生素耐药性的加速出现和传播对全球健康构成重大威胁。相当大比例的施用抗生素以基本未代谢的形式或活性代谢物形式通过尿液和粪便排出体外，从而进入污水系统。传统污水处理厂（WWTPs）通常并非为完全去除抗生素等微污染物而设计。为解决这一局限，最近通过的欧盟《城市污水处理指令2024/3019》要求较大型污水处理厂实施第四处理阶段，以去除微污染物并提高污水出水质量。先进处理技术正日益受到研究关注；然而，对其性能的可靠评估关键取决于能够定量痕量污染物的稳健且灵敏的分析方法。除污水处理厂出水等点源外，农业畜牧业通过过量施用粪肥构成抗生素向水生环境扩散的排放源。因此，全球范围内的地下水、地表水、河流甚至饮用水中均已检测到抗生素。由于抗生素具有广泛的物理化学多样性、复杂的样品基质以及通常在纳克/升至微克/升范围内的较低环境浓度，多种类抗生素在不同水生环境中的可靠测定在分析上仍具挑战性。液相色谱-串联质谱法（LC–MS/MS）或液相色谱-高分辨质谱法（LC–HRMS）是目前用于痕量水平药物定量的主要分析技术。基于大体积样品直接进样的LC–MS/MS方法省去了耗时的样品前处理步骤。然而，此类方法缺乏充分的样品净化，可能导致仪器污染和维护需求增加，且复杂环境样品中的基质效应程度仍存在争议。
固相萃取（SPE）仍是分析水体中抗生素时应用最广泛的样品前处理技术，因为它能够同时实现分析物富集和干扰性基质组分的去除。传统SPE工作流程涉及多个步骤，包括吸附剂活化、样品上样、淋洗和洗脱，使得操作过程劳动密集且耗时。此外，大多数工作流程在LC–MS分析前需要额外的溶剂蒸发（干化）和复溶步骤。为克服这些局限，在线SPE方法通过将萃取与色谱分离直接耦合而受到越来越多的关注，从而减少了人工操作并提高了重现性。另外，基于柱或盘式格式的自动化离线SPE平台已被开发，可同时萃取6–12个样品，但仍需大量样品体积（500–1000 mL）。近期，Azuma等人提出了一种结合机器人移液的96孔SPE方法用于废水中抗生素的测定。尽管该策略有效减少了样品体积和手动移液步骤，但相对较大的吸附剂质量（30和60 mg）需要较大的洗脱体积，从而限制了可实现的富集倍数，并需要在LC–MS分析前进行额外的蒸发和复溶步骤。更近期，有研究报道了使用Biomek i7工作站的自动化96孔SPE工作流程，用于同时测定废水中的69种药物和个人护理产品。然而，该工作流程在样品上样前需要进行活化和平衡步骤，随后用0.5 mL溶剂洗脱并在LC–MS/MS分析前对洗脱液进行稀释。因此，高度小型化的96孔SPE格式在最大化富集倍数的同时最小化LC–MS分析前样品制备步骤的全部潜力尚未被充分发掘。
在先前的研究中，研究人员建立了一种用于蓝藻毒素分析的自动化96孔SPE方法，并证明了无需中间溶剂交换即可对SPE洗脱液进行直接LC–HRMS分析的可行性。在此基础上，本研究探索了96孔SPE中微型化与自动化相结合用于环境水样中抗生素高通量分析的潜力。所提出的工作流程实现了100倍分析物富集，同时与传统SPE相比大幅减少了样品体积、样品制备时间和有机溶剂消耗。该工作流程设计覆盖多种具有不同物理化学性质的抗生素类别，包括氟喹诺酮类、大环内酯类、四环素类、磺胺类和甲氧苄啶。由于β-内酰胺类抗生素在水环境中稳定性有限且易发生水解，本研究未将其纳入。研究特别强调按照监管指南进行全面方法验证。最后，通过分析河水和污水处理厂出水样品证明了该工作流程在环境监测中的适用性。
**基于自动化96孔固相萃取-液相色谱高分辨质谱的环境水多类抗生素超痕量定量方法研究解读**
**一、研究背景与科学问题**
抗生素作为人类与兽医学中应用最广泛的药物类别之一，在全球范围内的消耗量持续攀升。虽然其在细菌感染治疗中不可或缺，但大量抗生素以原形或活性代谢物形式经尿液和粪便排入污水系统。传统污水处理厂（WWTPs）缺乏针对抗生素等微污染物的深度去除能力，导致抗生素持续输入环境。为此，欧盟于近期通过《城市污水处理指令2024/3019》，要求大型污水处理厂增设第四处理阶段以强化微污染物去除，这对痕量污染物的可靠定量分析提出了迫切需求。此外，农业活动中过量粪肥施用构成抗生素向水环境扩散的面源污染。目前，全球范围内的地下水、河流乃至饮用水中均已检出抗生素，其诱发并加速抗生素耐药性传播的风险已成为重大公共卫生威胁。
然而，多类别抗生素的同时可靠测定面临显著分析挑战：抗生素间理化性质差异大、环境基质复杂、环境浓度低至纳克/升至微克/升水平。液相色谱-串联质谱法（LC–MS/MS）和液相色谱-高分辨质谱法（LC–HRMS）是当前主流分析技术，但直接大体积进样方法缺乏充分净化，易导致仪器污染并受基质效应困扰。固相萃取（SPE）是应用最广泛的样品前处理技术，但传统SPE操作繁琐、耗时长，且大多需要蒸发复溶步骤。在线SPE虽减少人工操作，但自动化离线平台仍需要大体积样品（500–1000 mL）。已有96孔SPE方法因吸附剂用量大而需较大洗脱体积，富集倍数受限。因此，充分发掘高度小型化96孔SPE在最大化富集的同时简化LC–MS分析前处理流程的潜力，是本研究的核心出发点。
**二、研究内容与主要结论**
研究人员在前期蓝藻毒素自动化96孔SPE方法的工作基础上，建立了集微型化与自动化于一体的96孔固相萃取-液相色谱高分辨质谱（SPE–LC–HRMS）工作流程，用于环境水样中10种多类别抗生素的超痕量定量分析，涵盖氟喹诺酮类（环丙沙星CIP、左氧氟沙星LVX）、大环内酯类（阿奇霉素AZM、克拉霉素CLA、红霉素ERY、罗红霉素ROX）、四环素类（多西环素DOX）、磺胺类（磺胺噻唑STZ、磺胺甲噁唑SMX）以及甲氧苄啶（TMP）。该流程仅需5 mL样品即可实现100倍富集，单批次可在45分钟内完成最多48个样品的自动化萃取，全程有机溶剂消耗低于每样2 mL，且洗脱液可不经蒸发复溶直接进样分析，避免了中间溶剂交换步骤。系统的方法验证表明，所有目标分析物的方法定量限（MLOQs）均低于1 ng L?1，在超纯水、河水、河水与废水出水等多种基质中均表现出良好的准确度（82.6%–99.8%）和精密度（日内RSD≤9.1%，日间RSD≤13.2%）。将该方法应用于德国萨勒河8个采样断面的河水与某服务约10万人口城市污水处理厂连续7天的出水样品分析，结果显示10种目标抗生素中有8种在几乎所有样品中均被稳定检出，证实了该方法在复杂环境基质中开展大规模抗生素残留监测的适用性。该工作为即将实施的四级污水处理效果评估和大规模水环境监测提供了有力的技术支撑，具有良好的应用前景。
**三、主要关键技术方法**
研究人员采用的关键技术包括：（1）自动化96孔固相萃取平台：基于CyBio FeliX液体处理工作站，通过3D打印适配器集成真空 manifold，采用3 mg Oasis HLB Prime 96孔SPE板，无需活化和平衡步骤，利用V形底48深孔板实现5 mL样品的分步加载（7次移液），以63 μL 80:20 MeOH:H?O（v/v）洗脱获得50±2 μL最终提取液，实现100倍富集。（2）液相色谱-高分辨质谱联用分析：采用Accucore C18反相色谱柱（100×2.1 mm，2.6 μm），以含0.1%甲酸的水/乙腈体系为流动相，应用陡峭曲线（指数）梯度实现基线分离；Orbitrap Exploris 480质谱仪配备加热电喷雾离子源（HESI），采用选择离子监测（SIM）模式，分辨率90000，质量偏差<1.5 ppm，内标校正后定量可靠。（3）方法验证体系：参照DIN 32645、DIN 38402-51和DIN EN ISO 21676等标准，系统评价选择性、灵敏度（MLOD/MLOQ）、线性、基质效应（ME）、萃取回收率（ER）、内标校正效果、准确度及日内/日间精密度。方法应用涉及的样本包括：德国萨勒河8个采样点河水样品（2025年12月16日采集）和某德国城市污水处理厂（服务约10万人口）的7个瞬时样与7个24小时混合出水样。
**四、主要研究结果**
**LC–HRMS分析条件的优化。** 研究人员考察了固定相、流动相梯度和低体积进样条件。结果表明：Accucore C18色谱柱对所有目标分析物具有良好分离性能；与线性梯度相比，陡峭的曲线（指数）梯度显著扩大了保留时间窗口，实现了SMX、DOX和AZM的基线分离并减少了保留时间窗口重叠。针对50 μL低体积洗脱液，经优化自动进样器针头高度偏移（96孔板为0 mm，HPLC玻璃内插管为2.5 mm）和降低抽吸速度（1 μL s?1）后，两种样品格式均可实现可靠进样，且进样体积2 μL时所有分析物峰形良好。
**自动化96孔SPE工作流程的设计与优化。** 研究人员构建了可灵活处理1–48个样品的自动化平台：小样本量（1–8个）采用Choice Head和单块48孔板提供全部所需溶液，大样本量采用Head R96/1000 μL配合独立储液板。通过逐步降低z轴高度实现5 mL样品的定量转移，优化x轴偏移（+4 mm吸取，?3.5 mm分液）确保精确定位；在800 mbar负压和150 s间隔条件下完成样品加载（总耗时23 min），5 min干燥后于930 mbar下进行洗脱。结果实现洗脱后最终提取液体积稳定在50±2 μL，样品残留水分<5 μL（偏差<0.1%），全程有机溶剂消耗每样低于2 mL。
**SPE条件优化。** 实验均在pH 3.5和添加0.1% EDTA条件下进行。选择3 mg Oasis HLB Prime 96孔SPE板，利用其亲水-亲脂平衡特性实现多类抗生素的强保留，且HLB Prime吸附剂可省略活化和平衡步骤。加载实验证实5 mL样品在最高2500 ng L?1浓度下无穿透现象。洗脱溶剂筛选表明，80:20 MeOH:H?O（v/v）兼顾了SPE洗脱效率与LC–HRMS进样兼容性；在此条件下2 μL进样可获得良好峰形。综合考虑回收率与富集倍数，最终确定63 μL为最优洗脱体积（回收率损失≤16%）。
**方法验证与质量保证。** 所有分析物理论质量与实验质量偏差均在±1.5 ppm以内，13C同位素信号进一步确保了鉴定的可靠性。溶剂基校准和SPE基质匹配校准均通过原点回归（y=mx），线性良好。MLODs范围为0.02–0.21 ng L?1，MLOQs范围为0.07–0.68 ng L?1。基质效应评估显示，废水出水中的基质抑制效应最为显著（如D8-LVX在低浓度下达?44.4%），而分析物特异性同位素标记内标有效补偿了基质效应和萃取回收率波动，所有分析物内标校正后响应偏差均在±15%以内。萃取回收率在多数基质和浓度下为60%–90%。在超纯水和溪水中的准确度为82.6%–99.8%，日内精密度（RSD?）为0.8%–9.1%，日间精密度（RSDb）为1.6%–13.2%。
**环境水样应用。** 在污水处理厂出水样品（瞬时样和24小时混合样）中，8种目标抗生素在所有样品中均被定量检出，其中AZM浓度最高（瞬时样最高616 ng L?1，混合样最高568 ng L?1），SMX和TMP持续处于较高浓度水平，DOX在所有样品中均低于MLOQ，STZ无检出信号。瞬时样与混合样的浓度变化趋势总体一致。在萨勒河河水样品中，8种抗生素在多数断面被检出，SMX浓度最高（15.3–21.4 ng L?1），其次为AZM（1.75–10.0 ng L?1）；断面S7和S8处多数抗生素浓度明显降低，可能受淡水汇入稀释影响，但SMX浓度相对稳定，提示存在额外输入源。
**五、讨论与结论总结**
讨论部分指出，本方法的核心分析优势在于所有目标分析物均配备对应的同位素标记内标，实现了逐分析物特异性的基质效应和萃取变异性校正，优于多数多残留方法中采用类别内共享内标的策略。低标准偏差表明自动化样品制备、直接进样与特异性内标校正相结合显著提高了方法重现性。研究人员同时指出，高度微型化的SPE格式在应对高复杂度废水时的净化能力仍存在局限，如氟喹诺酮类在废水出水中出现最高达45%的离子抑制；扩展至β-内酰胺类等其他抗生素需进一步方法开发。鉴于欧盟指令2024/3019的实施将催生对高灵敏度分析方法的迫切需求，本方法凭借其超高灵敏度和高通量特性，适用于处理出水微污染物去除效果的监测评估。
研究结论：研究人员开发了一种用于环境水中多类抗生素LC–HRMS分析的自动化高通量96孔SPE工作流程。微型化SPE方案实现了100倍分析物富集，同时大幅减少了样品体积、样品制备时间和有机溶剂消耗。所获得的低体积SPE洗脱液可直接进样，消除了额外的蒸发、复溶和转移步骤，充分发挥了微型化SPE格式的分析潜力。全面方法验证表明，该方法可在不同水基质中实现所有目标分析物在环境相关浓度下的稳健定量。将该工作流程应用于河水和污水处理厂出水样品证实了其在环境监测中的适用性，10种目标抗生素中有8种在几乎所有样品中被稳定检出。该方法为环境水中抗生素残留的高通量监测提供了有力工具，可满足大规模水质监测日益增长的需求。
