《Journal of Comparative Pathology》：Evaluation of cyclin-dependent kinase 4 immunolabelling and a germline p.G201S variant as predictors of clinical outcome in canine mammary tumours: a preliminary study
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细胞周期蛋白依赖性激酶4（cyclin-dependent kinase 4, CDK4）是G1/S期转换的调节因子，在癌症中经常失调。尽管在人类乳腺癌中已被广泛研究，但其在犬乳腺肿瘤中的意义仍知之甚少。这项初步研究探讨了CDK4免疫组织化学（immunohi
细胞周期蛋白依赖性激酶4（cyclin-dependent kinase 4, CDK4）是G1/S期转换的调节因子，在癌症中经常失调。尽管在人类乳腺癌中已被广泛研究，但其在犬乳腺肿瘤中的意义仍知之甚少。这项初步研究探讨了CDK4免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）及CDK4激酶结构域第201位残基周围片段的序列变异的预后价值。33只前瞻性入组的、肿瘤累及单侧乳腺链的雌性犬接受了单侧根治性乳房切除术。对一段89-bp的CDK4片段进行测序，并与CDK4和雌激素受体（oestrogen receptor, ER）免疫组织化学及临床病理随访配对。30只犬（11例死亡）进入主要分析（3例样本欠佳）。错义变异c.601G>A（p.G201S）在30只犬中的7只（23%；等位基因频率15%）中被鉴定到，但与任何临床病理变量或生存期均无关联（风险比[hazard ratio, HR] 1.54，95%置信区间[confidence interval, CI] 0.39–6.00）。CDK4免疫标记与ER免疫标记相关（优势比8.75，95% CI 1.21–63.4；P = 0.058）。CDK4免疫标记与生存期无关（HR 2.73，95% CI 0.78–9.48；P = 0.11）；经晚期调整后，仅达到临界显著性（HR 3.92，95% CI 1.01–15.2；P = 0.048），但该结果未通过最坏情况敏感性分析。12个月时间依赖性受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线下面积为0.79（95% CI 0.56–0.96），阴性预测值（negative predictive value, NPV）为93%。p.G201S极可能代表一种常见的种系多态性，而非驱动事件。CDK4免疫标记追踪ER阳性表型，但不是独立的预后标志物；其较高的短期NPV提示其可作为排除工具，需在更大的队列中验证。
在兽医肿瘤学中，乳腺肿瘤（mammary gland tumours, MGTs）是未绝育雌犬最常见的肿瘤，约占外科切除病例的一半为组织学恶性，其生物学行为从良性单纯腺瘤到高度转移性间变性癌差异巨大。尽管已确立多种临床病理预后因素，个体患者的结局预测仍不完善，因此需要能够细化诊断分层的分子标志物。p16–细胞周期蛋白D1–CDK4/6–Rb轴是G1/S期转换的主调节器。细胞周期蛋白依赖性激酶4（cyclin-dependent kinase 4, CDK4）与D型细胞周期蛋白形成复合物，磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白（Rb），释放E2F转录因子，驱动DNA复制。在人类乳腺癌中，该轴的过度活化与雌激素受体阳性（estrogen receptor-positive, ER+）表型密切相关，选择性CDK4/6抑制剂已成为ER+/人表皮生长因子受体2阴性（HER2?）晚期疾病的一线治疗。然而，在犬乳腺肿瘤中，CDK4的分子特征远远落后于组织病理学知识。此前一项体外研究表明CDK4/6抑制在犬MGT细胞系中具有抗肿瘤效应，但CDK4蛋白在肿瘤组织中的存在及CDK4序列变异尚未被系统表征。目前存在三个空白：CDK4编码变异谱未知；CDK4蛋白存在与ER阳性表型之间的关系未量化；CDK4的预后价值未与共识指南推荐的临床病理因素对比评估。因此，研究人员开展这项初步研究，旨在通过免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）、针对第201位残基周围激酶结构域片段的靶向Sanger测序和时间-事件分析，评估CDK4蛋白存在及种系遗传变异在犬MGT中的生物标志物价值。
研究人员采用前瞻性、非随机设计，入组33只肿瘤累及单侧乳腺链的雌犬，所有犬均接受单侧根治性乳房切除术。所有程序经圣保罗州立大学兽医学与动物科学学院动物使用伦理委员会批准。对福尔马林固定石蜡包埋组织进行CDK4和ER免疫组织化学；提取基因组DNA后PCR扩增89-bp CDK4片段并进行双向Sanger测序；术后至少随访2年。其中30只犬进入主要分析，3只因测序正反向共识身份低于90%且散在杂合调用（符合模板混合）被排除；另1例因缺乏CDK4序数评分仅被排除于ROC分析。队列中位年龄12岁，全部为恶性肿瘤，最常见的组织学类型为混合型癌中的癌（33%）和复杂癌（30%）。组织学分级I级占60%，III级占30%；临床分期低分期（肿瘤-淋巴结-转移[tumour-node-metastasis, TNM] I–III）占73%，晚期（IV–V）占27%。ER IHC在25/30只犬中技术可判读，其中36%为ER阳性；CDK4 IHC阳性占30%。随访期间50%发生转移性疾病，37%死亡，中位随访24个月。
3.1 Cohort（队列）
通过描述性统计呈现了30只犬的完整临床病理特征。所有肿瘤均为恶性，组织学亚型多样，以复杂/混合型癌为主（63%）。生存分析中共有11例确认死亡，19例删失。
3.2 CDK4 immunohistochemistry（CDK4免疫组织化学）
CDK4免疫标记为细胞核阳性，伴可变细胞质共染。以二分法判读，9/30（30%）肿瘤为CDK4阳性。在预设的关联分析中，CDK4 IHC阳性与ER IHC阳性存在关联（优势比8.75，95% CI 1.21–63.4；未校正P=0.058；Holm校正P=0.23），该效应方向与人类乳腺癌的机制预期一致，但校正后未达到传统显著性。CDK4阳性与复杂/混合癌组织学、随访期间转移或晚期均无关联；附加分析显示CDK4阳性与组织学分级也无显著关联（高级别对比低级别：优势比0.20，95% CI 0.02–1.94；P=0.21）。
3.3 CDK4 variant spectrum and associations（CDK4变异谱和关联）
整个测序区域仅鉴定到一个错义变异：c.601G>A（p.G201S），位于激酶结构域。30只犬中7只（23%）为携带者（5只杂合，2只纯合），变异等位基因频率15%。p.G201S携带状态与预设的六个临床病理变量（CDK4 IHC、ER IHC、随访期间转移、复杂混合瘤组织学、晚期和年龄）均无显著关联，经Holm–Bonferroni校正后无统计学意义；与总生存期亦无关联（HR 1.54，95% CI 0.39–6.00；P=0.54）。包含三只排除样本的技术敏感性分析结果与主要分析一致。因此，p.G201S更可能代表常见种系多态性而非驱动事件。
3.4 Survival analysis（生存分析）
Kaplan–Meier曲线显示CDK4阳性犬在随访前8个月内生存率明显下降，之后曲线稳定；但log-rank检验未达显著（P=0.10）。单变量Cox回归中，CDK4 IHC阳性与总生存无显著关联（HR 2.73，95% CI 0.78–9.48；P=0.11）；晚期（TNM IV–V）的HR为3.04（95% CI 0.84–10.99；P=0.089）。由于只有11个死亡事件，多变量模型仅限双变量Cox回归。当以晚期作为校正变量时，CDK4的HR升至3.92（95% CI 1.01–15.2；P=0.048），达到边界显著性，但该效应未通过后续最坏情况敏感性分析，且比例风险假设被违反（Schoenfeld检验P=0.015）。时间依赖性ROC分析采用预设CDK4序数评分（0–3），12个月标志处AUC为0.79（95% CI 0.56–0.96），24个月为0.64，36个月为0.75。以临床截断值（评分≥1）应用时，12个月时敏感性83%、特异性78%、阳性预测值56%、阴性预测值（negative predictive value, NPV）93%，阳性似然比3.75。Harrell's一致性指数为0.66。
3.5 Worst-case sensitivity analysis（最坏情况敏感性分析）
将全部删失病例假设为在删失时间死亡后重新分析。p.G201S的HR几乎不变（HR 1.53，95% CI 0.59–3.98；P=0.38），确认该变异阴性结果的稳健性；而CDK4 IHC阳性的HR塌缩至1.00（95% CI 0.39–2.57；P=0.99），表明其表观预后信号对删失假设敏感，可能被夸大。
在讨论中，研究人员将结果分为三个层面解释。第一层，p.G201S是测序片段中唯一的编码变异，其与任何临床病理变量和生存均无关联，等位基因频率15%更符合常见多态性而非体细胞驱动事件；最终确认需要配对生殖系DNA测序。第二层，CDK4 IHC与ER IHC的关联是本研究最稳定的发现，点估计大且方向与人类乳腺癌腔面肿瘤依赖cyclin D1–CDK4/6信号一致；未通过Holm校正可能受限于样本量和保守校正策略。犬MGT中ER阳性比例可观，因此ER阳性亚群可能是CDK4/6靶向治疗最可能获益的群体。第三层，CDK4 IHC作为独立预后标志物的证据薄弱：单变量无显著，分期调整后边界显著但脆弱，最坏情况分析中消失，且临床分期仍是主导结局相关因素。这与人类文献一致，即CDK4蛋白本身无独立预后价值，而CCND1扩增更一致地与不良结局相关。时间依赖性ROC提示CDK4 IHC在12个月的高NPV（93%）使其可能作为短期排除工具，但阳性预测值仅56%，需独立队列验证。
研究结论部分可翻译为：在这项对30只患有乳腺肿瘤的犬进行的初步研究中，CDK4错义变异p.G201S表现为一种可能常见的种系多态性而非驱动事件：它与任何临床病理变量均无关联，且对总生存期无信号。CDK4 IHC状态追踪ER阳性表型，但不是独立的预后因素：其与生存期的单变量关联不显著，分期调整后的关联脆弱且未通过最坏情况敏感性分析，临床分期仍是主要结局相关因素。最稳定的临床观察是临床截断值下CDK4 IHC的12个月NPV高达93%，将该标志物定位为一种值得在验证队列中测试的潜在短期排除工具。该研究作为初步工作，为犬乳腺肿瘤中CDK4的分子特征提供了首个编码变异数据，并提示未来针对ER阳性亚群的CDK4/6抑制剂研究可能具有转化价值。
