纤溶酶系统研究：从脱脂乳到浓缩牛奶蛋白（MPC）——加工对蛋白酶活性与蛋白水解的影响

《Journal of Dairy Science》：Investigating the plasmin system: From skim milk to milk protein concentrate

　　

在浓缩牛奶蛋白（MPC）生产中，纤溶酶系统的激活剂和抑制剂被同时浓缩，彼此作用相互拮抗，从而使得对MPC中纤溶酶驱动蛋白水解水平的预测变得困难。此外，有理由推测，浓缩后的纤溶酶系统酶类可能引起其各自活性的变化。因此，研究人员无法预测牛奶蛋白浓缩对以MPC为原料的模型饮料蛋白水解潜力或风险的影响。本研究旨在表征常见乳饮料配料MPC85中纤溶酶系统的活性。本研究中，研究人员采用中试规模膜超滤装置和迷你喷雾干燥器制备了MPC85粉末，并利用N-琥珀酰-Ala-Phe-Lys-7-酰胺基-4-甲基香豆素（Suc-Ala-Phe-Lys-AMC）的荧光评估MPC85及其加工过程中各工艺流的表观纤溶酶活性。此外，采用液相色谱法测定了不同老化时间（在37°C下分别储存0、3、7和14天）的酪蛋白水解程度。就固形物基础而言，超滤（UF）+渗滤（DF）过程及喷雾干燥均未影响表观纤溶酶活性。然而，在储存初期（第3天），MPC85粉末中的酪蛋白水解率（约76%）与原料乳（约67%）无统计学差异。14天后，所有样品的酪蛋白水解几乎完全（>90%）。这些结果表明，牛奶蛋白的浓缩增强了荧光纤溶酶测定中的竞争性抑制，并且相对于牛奶，MPC85中纤溶酶对酪蛋白的真实水解速率变化不大。此外，在储存期间，纤溶酶和纤溶酶原激活物的活性均升高，这可能是由于纤溶酶原被激活以及纤溶酶将激活物转化为其双链形式所致。这些发现阐明了MPC加工对受控储存期内纤溶酶活性和蛋白水解动态的影响。这一知识可指导并推动进一步研究，通过降低MPC85在各种食品配方中的蛋白水解潜力来改善其品质属性。

**从脱脂乳到浓缩牛奶蛋白：纤溶酶系统活性与蛋白水解动力学的系统研究**

**研究背景与问题**

乳中天然存在的纤溶酶（plasmin, PL）系统是导致乳制品中酪蛋白水解的重要因素，与超高温灭菌（UHT）乳和乳蛋白饮料的凝胶化、沉淀等质量问题密切相关。在浓缩牛奶蛋白（milk protein concentrate, MPC）生产中，超滤（ultrafiltration, UF）和渗滤（diafiltration, DF）过程会同时浓缩纤溶酶系统的各组分，包括纤溶酶原（plasminogen, PG）、纤溶酶原激活物（plasminogen activator, PA）以及相应的抑制剂（如纤溶酶抑制剂PI和纤溶酶原激活物抑制剂PAI）。这些组分在浓缩后相互作用，使得对MPC中PL驱动的蛋白水解水平的预测变得困难。已有研究多集中于脱脂乳体系，而关于MPC加工各步骤（尤其UF/DF和喷雾干燥）对PL系统活性和蛋白水解影响的系统数据仍然缺乏。因此，本研究旨在表征常见乳饮料配料MPC85（蛋白质含量约85%干基）从原料乳到粉末加工过程中PL系统活性的变化，并评估其在加速货架期内的酪蛋白水解动态。

**研究内容与意义**

研究人员利用中试规模膜超滤装置和喷雾干燥器制备了MPC85粉末，并采集了原料脱脂乳（feed）、UF渗透液、MPC85截留液、重组饲料（由截留液和渗透液按比例混合以模拟原料组成）以及重新分散的MPC85粉末等样品。通过荧光底物法测定表观PL活性和PA活性，采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）定量α_s1-酪蛋白（α_s1-CN）的水解程度。样品在37°C下加速老化0、3、7、14天后进行分析。研究发现：UF/DF和喷雾干燥工艺本身并未显著改变基于固形物的表观PL活性；尽管MPC85样品蛋白质含量约为原料乳的2倍，但α_s1-CN的相对水解百分比在两种体系中相似（早期约70%，14天后>90%）；然而，由于MPC85蛋白质浓度更高，其绝对摩尔水解量显著高于原料乳。储存期间，PL和PA活性均表现出先升后降的动态变化，这与PG的逐步激活和底物消耗有关。这些发现说明MPC加工浓缩了蛋白水解的“总量”，但并未改变PL对酪蛋白水解的内在速率。该研究为高蛋白乳饮料的货架期稳定性预测提供了重要参考，并提示在比较不同蛋白浓度样品时需谨慎解读表观PL活性。

**关键技术方法**

本研究采用中试规模错流过滤系统（10 kDa聚醚砜膜，Alfa Laval）和实验室喷雾干燥器（Büchi B-290）制备MPC85样品。原料来源于北卡罗来纳州立大学乳品加工试验工厂的巴氏杀菌脱脂乳。关键方法包括：荧光底物Suc-Ala-Phe-Lys-AMC用于测定表观PL和PA活性；RP-HPLC（C18柱）用于定量α_s1-CN的剩余量；样品统一标准化为9%（w/w）总固形物后进行酶活测定；加速老化实验于37°C进行，时间点为0、3、7、14天。

**研究结果**

（1）MPC85及其加工工艺流的特征：成分分析显示，UF/DF过程使蛋白质含量从4.1%增加到13.3%，总固形物从9.4%增加到14.5%；pH从6.6升至6.9，电导率显著下降，而离子钙浓度与原料乳无显著差异，提示酪蛋白胶束结构可能发生变化。ζ-电位绝对值增大，表明胶束表面电荷增加。喷雾干燥后的粉末重新分散后，水动力半径从86.6 nm增至104.4 nm，说明干燥过程引起一定程度的蛋白聚集。SDS-PAGE表明UF/DF未造成血清蛋白的明显泄漏，所有主要乳蛋白均被保留在截留液中。

（2）纤溶酶活性分析：在固形物基础上，所有样品在同一老化时间的表观PL活性均无显著差异（P>0.05）；但在蛋白基础上，新鲜样品（d 0）中截留液和粉末的PL活性显著低于原料乳，这种差异在储存期间持续存在。储存期间，所有样品的PL活性在d 3–7达到峰值后下降。该现象与PG逐渐转化为PL以及后期底物消耗或酶自溶有关。UF/DF和喷雾干燥本身对PL活性无显著影响，因为原料乳与重组饲料、截留液与粉末之间的活性均无差异。

（3）纤溶酶原激活物活性分析：PA活性在固形物基础上与PL活性趋势类似，但截留液和粉末的PA活性在血浆酶原基础下与原料乳相近。在蛋白基础上，老化7天后浓缩样品表现出较低的PA活性，提示PAI可能被富集。值得注意的是，原料乳、重组饲料和截留液的PA活性随储存时间逐渐上升，而喷雾干燥的粉末未显示明显变化，推测喷雾干燥可能使热不稳定的t-PA失活，而保留u-PA活性。PA活性的上升可能是PL水解将单链PA转化为双链活性形式所致。

（4）液相色谱蛋白水解分析：RP-HPLC结果显示，在d 3时所有样品的α_s1-CN相对水解百分比约为60–75%，且不同样品间无统计学差异；d 7后接近完全水解（>90%）。然而，由于截留液和粉末样品中初始蛋白含量较高，其绝对水解量（以峰面积计算）显著高于原料乳。重组饲料与原料乳之间没有差异，说明UF/DF过程并未导致PL系统组分的不可逆改变。研究进一步计算了水解指数和每日平均水解速率，表明水解速率在储存早期最高，