《Journal of Dairy Science》：Whey protein phospholipid concentrate at the interface of function and health: Heat-induced protein interactions, bioactivity, and choline delivery
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牛奶是一种营养丰富的生物体液，对早期发育至关重要，其中乳脂肪球膜（milk fat globule membrane，MFGM）在认知、骨骼、免疫和胃肠道健康中发挥着基础性作用。在消费者对高蛋白和可持续原料需求不断增长的驱动下，乳品工业日益聚焦于
摘要专业翻译
牛奶是一种营养丰富的生物体液，对早期发育至关重要，其中乳脂肪球膜（milk fat globule membrane，MFGM）在认知、骨骼、免疫和胃肠道健康中发挥着基础性作用。在消费者对高蛋白和可持续原料需求不断增长的驱动下，乳品工业日益聚焦于副产物，如乳清蛋白磷脂浓缩物（whey protein phospholipid concentrate，WPPC）——一种通过微滤（microfiltration）获得的、富含MFGM蛋白和极性脂质的组分。WPPC含有高水平的酪蛋白（caseins）和乳清蛋白（whey proteins），并显著富集膜结合糖蛋白和磷脂，这些成分赋予其功能性和营养价值。热处理虽对安全性和货架期至关重要，但会诱导MFGM蛋白和脂质组分发生重塑。热加工促进乳清蛋白去折叠和聚集，通过共价和非共价相互作用驱动其与MFGM结合，同时重塑MFGM脂质微域（lipid microdomains），改变磷脂分布，并增加脂质和蛋白质氧化的敏感性。这些界面变化可改变MFGM蛋白的可及性、酶活性、氧化稳定性以及消化衍生肽段的释放，最终影响从WPPC中下游分离天然MFGM生物活性物质的效果，以及基于膜和溶剂的分级分离策略的性能。研究还讨论了WPPC作为磷脂结合营养素（包括胆碱（choline））功能性递送基质的潜在新兴机遇，并置于转化营养学和下一代乳品配料开发的背景下加以阐述。
论文解读文章
一、研究背景与研究意义
牛奶是一种营养密集的天然生物体液，含有蛋白质、脂质、碳水化合物、维生素和矿物质等多种成分，能够满足婴幼儿生长发育的营养需求。在牛奶的众多组分中，乳脂肪球膜（milk fat globule membrane，MFGM）因其在促进认知发育、骨骼健康、免疫功能及胃肠道健康方面的独特作用而备受关注。MFGM是包裹在乳脂肪球（milk fat globule，MFG）外围的三层膜结构，厚度约10–20 nm，既作为抵抗脂解和氧化的保护屏障，又作为生物活性蛋白和极性脂质的功能平台。随着高蛋白食品需求增长和可持续发展优先级提升，乳品行业日益重视营养密集的副产物流的开发利用，乳清蛋白磷脂浓缩物（whey protein phospholipid concentrate，WPPC）便是其中之一。WPPC是在乳清蛋白浓缩物（whey protein concentrate，WPC）生产过程中的微滤阶段产生的副产物，其独特之处在于同时富集了酪蛋白、乳清蛋白以及MFGM相关蛋白和极性脂质。研究表明，WPPC中MFGM蛋白占总蛋白相对丰度的约23%，远高于牛乳中通常的1–2%和人乳中的1%，其中含量最高的MFGM蛋白包括GLYCAM-1（7%）、嗜乳脂蛋白（butyrophilin，BTN，5%）、乳凝集素（lactadherin，4.45%）、黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO，2.25%）和心型脂肪酸结合蛋白（<2%）。同时，WPPC脂质部分含有约20%的极性脂质，包括磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine，PC）、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）、鞘磷脂（sphingomyelin，SM）和磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS），这些成分对膜结构、脂质消化和细胞信号传导至关重要。
然而，正是这种营养丰富性使乳制品极易受到微生物污染。为确保安全、延长货架期并维持产品质量，热处理成为乳品制造中的基础步骤，常见方法包括高温短时（high-temperature short-time，HTST）巴氏杀菌、低温长时（low-temperature long-time，LTLT）巴氏杀菌和超高温（ultra-high temperature，UHT）处理。热处理在确保微生物安全的同时，会深刻影响乳成分的结构完整性和功能性。乳清蛋白因具有复杂的二级和三级构象而对热高度敏感，而酪蛋白相对耐热。更重要的是，MFGM在热处理过程中也会发生显著的组成和结构改变，其中一个显著效应是变性乳清蛋白附着到MFGM表面，影响乳制品的功能品质和营养价值。此外，工业热处理还会增加牛乳等复杂食品基质对氧化的敏感性。WPPC因其高蛋白和高磷脂含量，在加工和储存过程中尤其容易发生脂质和蛋白质氧化。
目前，热诱导蛋白去折叠和聚集的机制基础在牛乳中已被广泛研究，但相对较少关注这些分子事件如何传导至下游副产物流。现有文献大多隐含假设全脂乳或稀奶油中的观察结果可直接推广至乳清衍生原料，但这一假设在WPPC这类蛋白-脂质界面高度浓缩且加工历史累积的基质中日益站不住脚。因此，系统理解热处理如何改变乳/乳清蛋白和MFGM组分及其发生阶段，对于优化加工工艺、提高特定功能性生物活性组分的回收和分离富集效率至关重要。与此同时，乳品磷脂作为生物活性营养素（包括磷脂结合胆碱）递送系统的潜力日益受到关注。胆碱在脂质代谢、神经递质合成和一碳代谢中发挥重要作用，但许多人群（尤其是老年人和绝经后女性）的摄入量不足。WPPC天然富含磷脂酰胆碱和其他极性脂质，因此其作为功能性乳品配料和转化营养学平台的研究价值日益凸显。
二、研究内容概述
该综述系统整合了热加工对牛乳及乳制品中MFGM组成、结构和功能修饰的现有证据，特别聚焦于WPPC这一生物活性丰富但加工敏感的基质。研究人员首先阐述了MFGM的结构组成，包括其三层膜结构、蛋白质分类（整合型、外周型和松散结合型）以及脂质的不对称分布特征；随后系统分析了热处理对酪蛋白、乳清蛋白和MFGM蛋白及脂质的影响机制，包括β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）通过Cys121巯基引发的硫醇-二硫键交换反应、非共价相互作用（疏水作用、氢键、静电作用）在蛋白-MFGM结合中的贡献，以及热诱导脂质微域重组和磷脂分布改变对界面蛋白吸附的促进作用；进而讨论了这些热诱导变化对MFGM蛋白生物活性（如XO酶活性、抗菌功能、免疫调节）的影响，以及WPPC为何对热历史尤为敏感——其高蛋白-脂质界面接触频率、高氧化敏感性和较低的聚集缓冲能力放大了上游热处理的后果；最后探讨了防止非MFGM蛋白结合的策略、WPPC中目标化合物（尤其是磷脂和胆碱）的分离提取方法，以及WPPC作为功能性递送基质的应用前景。
三、主要关键技术方法
该综述主要基于对已有文献的系统梳理和整合分析。涉及的关键技术方法包括：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）用于分析MFGM蛋白组成变化；蛋白质印迹（Western Blot）用于特定蛋白的定性和半定量检测；激光共聚焦扫描显微镜（confocal laser scanning microscopy）用于观察脂肪球界面脂质和蛋白分布；激光光散射和颗粒电泳用于测定脂肪球尺寸和ζ-电位；薄层色谱（thin-layer chromatography，TLC）和脂质组学（lipidomics）用于分析磷脂组成和氧化产物；差示扫描量热法（differential scanning calorimetry，DSC）用于研究脂质相变行为；蛋白质组学和糖蛋白组学用于鉴定MFGM蛋白和N-聚糖谱；超临界二氧化碳（SC-CO2）萃取和乙醇辅助萃取用于磷脂分离。部分引用的研究使用了商业规模或中试规模的加工条件，如HTST巴氏杀菌、微滤膜分离（如1.4 μm孔径膜）和喷雾干燥等。
四、主要研究结果
MFGM的结构与组成
MFGM由三层结构组成：富含极性脂质的内层、以蛋白质为主的中层和由极性脂质与特异性膜蛋白交错组成的外层双分子层。MFGM蛋白在牛乳总蛋白中仅占1–2%，但占MFGM总质量的25–70%。蛋白质组学分析已在牛MFGM中鉴定出超过632种蛋白，其中嗜乳脂蛋白（BTN）约占MFGM总蛋白的40%，黄嘌呤氧化酶（XO）约占12–13%。MFGM蛋白的糖基化对其生物活性和稳定性至关重要，黏蛋白（MUC1/MUC15）、乳凝集素（MFGE8）、CD36和BTN等关键蛋白均发生广泛糖基化。在脂质方面，MFGM脂质中约70%为中性脂质（主要为甘油三酯），约30%为极性脂质。极性脂质虽然仅占全乳脂质的0.2–1%，却占MFGM脂质部分的26–40%，并占全乳极性脂质的60–70%。磷脂酰胆碱（PC，约35%）和磷脂酰乙醇胺（PE，约30%）是含量最丰富的甘油磷脂。含胆碱磷脂（PC和SM）主要分布在外层膜表面，而PE、PS和磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol，PI）倾向于分布在内层。鞘磷脂因具有长链饱和N-酰基链而具有较高熔点（约35°C），可形成紧密堆积的有序微域。
热处理对酪蛋白的影响
酪蛋白相对于乳清蛋白具有较高的热稳定性，其与MFGM重塑的关联主要通过与变性乳清蛋白的间接相互作用实现。当加热超过约65°C时，β-LG去折叠并通过硫醇-二硫键交换反应与κ-酪蛋白形成共价复合物，这些复合物可与酪蛋白胶束表面结合或留在血清相中，进而可能通过κ-酪蛋白-MFGM关联直接或间接地将乳清蛋白桥接到MFGM上。从加工角度看，酪蛋白-乳清蛋白复合物并非MFGM重构的主要驱动因素，但增大的聚集体尺寸会促进微滤过程中的膜污染，使后续MFGM蛋白和磷脂的分级分离复杂化。
热处理对乳清蛋白的影响
乳清蛋白如α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-La）、β-LG和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）因具有复杂的二级和三级结构而对热特别敏感。α-La约在66°C开始去折叠，在100°C以上长时间暴露会导致不可逆聚集；BSA更为热敏感，在55°C即开始去折叠，约60°C发生聚集；β-LG的热行为最为复杂，涉及多步骤过程。β-LG通常以非共价二聚体形式存在，加热至40°C以上时平衡向单体方向移动，70°C以上变性不可逆。β-LG通过三种机制聚集：类型1涉及单体去折叠和Cys121游离巯基暴露，通过硫醇-二硫键交换形成共价二硫键聚合；类型2通过非特异性疏水和静电相互作用驱动进一步复合和聚合物形成；类型3涉及β-LG与乳中其他蛋白的非特异性结合。β-LG聚集动力学随温度变化：90°C以下需要高活化能且遵循一级动力学，90°C以上活化能显著降低且转为二级动力学。变性β-LG还可与κ-酪蛋白结合，进而促进α-La掺入蛋白-MFGM复合物。
热处理对MFGM组成的影响
热处理过程中乳清蛋白附着到MFGM是一个复杂现象，涉及多种分子相互作用。关键机制之一是变性乳清蛋白与MFGM膜蛋白之间形成二硫键，这一过程由MFGM多肽的高半胱氨酸含量促进。β-LG的Cys121反应性巯基在热诱导去折叠后暴露，引发硫醇-二硫键交换反应。使用N-乙基马来酰亚胺（N-ethylmaleimide，NEM）封闭Cys121可显著减少聚集，证实了其核心作用。然而，β-LG与MFGM的结合不能仅归因于二硫键，疏水相互作用、氢键和静电作用等非共价相互作用也显著贡献。热加工不仅促进β-LG整合，还会置换天然MFGM蛋白。例如，将牛奶加热至80°C持续3分钟，天然MFGM蛋白含量从每100 g脂肪球0.67 g降至0.57 g。PAS 6/7在80°C开始从MFGM解离，暴露整合膜蛋白和极性脂质尾部，这些位点随后通过疏水相互作用成为β-LG的结合位点。XO和BTN的二硫键连接复合物在58–60°C即开始形成，早于β-LG变性，而PAS 6/7约在80°C聚集。此外，脂多糖结合蛋白、组织蛋白酶D和溶酶体α-甘露糖苷酶等其他次要蛋白在85°C时也会与MFGM结合。酪蛋白胶束可能作为β-LG和MFGM之间的分子桥梁：β-LG加热时与κ-酪蛋白形成二硫键，而κ-酪蛋白也已知可与MFGM结合，从而提供β-LG与膜关联的间接途径。
热处理对MFGM蛋白生物活性的影响
热处理不仅改变MFGM的界面结构和蛋白组成，还通过变性、聚集、氧化、糖基化暴露改变和消化可及性变化调节其组成蛋白的生物活性。黄嘌呤氧化还原酶（xanthine oxidoreductase，XO/XDH）是MFGM中最丰富的酶蛋白之一，通过嘌呤代谢过程中产生活性氧和活性氮参与先天抗菌防御。研究表明，热处理因构象去折叠和钼-铁-硫活性位点簇的破坏而逐步降低乳中XO催化活性，部分失活始于巴氏杀菌温度（≥65°C），在UHT或高压灭菌处理中变得显著。加热还促进XO与其他MFGM蛋白及变性乳清蛋白通过二硫键介导的聚集，降低其表面可及性和溶解性。商业规模数据显示，对牛乳和甜乳清的上游HTST巴氏杀菌步骤可测量地降低MFGM相关蛋白（包括XO/XDH和乳凝集素）向乳清原料中的保留，并显著降低XO活性。嗜乳脂蛋白（BTN）在加热条件下可提取性降低，并参与高分子量复合物的形成，包括与XO和/或β-LG的二硫键连接聚集体。乳凝集素（MFGE8）在强烈热处理后因被置换和与乳清蛋白共聚集而在MFGM组分中的丰度下降，甲硫氨酸和半胱氨酸残基的热诱导氧化可能进一步损害其受体结合域。黏蛋白（MUC1、MUC15）和PAS6/7是高度糖基化的蛋白，负责脂肪球的位阻稳定和病原体结合抑制。加热至75–80°C以上导致PAS6/7部分脱离膜表面，暴露疏水脂质域，随后结合变性β-LG。热暴露还可能通过蛋白聚集诱导聚糖重排或掩蔽，降低唾液酸化和岩藻糖化基序的可及性，从而削弱抗菌诱饵功能。CD36虽相对热稳定，但其广泛的N-糖基化在高温处理中易通过美拉德反应和氧化应激受到间接修饰，可能影响配体结合和膜定位。
热处理对MFGM脂质的影响
MFGM是一个高度组织的蛋白-脂质组装体，极性脂质和胆固醇构成锚定膜蛋白并调节其空间取向、稳定性和生物可及性的结构基质。热加工可通过多种机制破坏这一脂质基质，包括相变、脂质微域的侧向重组、不饱和磷脂的氧化以及特定脂质类别从外层膜叶的部分耗竭。界面研究表明，热处理可改变脂肪球尺寸、表面电荷和界面组成，巴氏杀菌条件通常影响外层叶相关脂质，而更剧烈的处理（如超巴氏杀菌/UHT/灭菌）会扰动更广泛的脂质类别，包括通常富集于内层叶的脂质。巴氏杀菌主要耗竭外层膜磷脂（SM和PC），而超巴氏杀菌还会影响内层脂质（PI和PE）并降低脂肪球的ζ-电位。这种脂质重组增加了膜通透性，暴露疏水脂质域，促进变性乳清蛋白（尤其是β-LG）在脂肪球表面的吸附和共价附着。因此，热诱导脂质重塑是MFGM界面蛋白聚集的先决条件而非次要效应。此外，工业加热增加了MFGM相关脂质组分中氧化脂质（oxylipins）和脂质氧化产物的形成，这些氧化产物可驱动蛋白质的二次修饰（羰基化和交联），降低酶活性并损害功能生物活性。
WPPC为何对热历史尤为敏感
WPPC代表了一种独特加工敏感的乳品基质，因为它在一个界面系统中同时浓缩了变性乳清蛋白和MFGM相关脂质及糖蛋白。与全脂乳不同（热诱导相互作用发生在相对稀释的蛋白质环境中），WPPC通过增加的蛋白-脂质接触频率、升高的氧化敏感性和降低的聚集缓冲能力放大了上游热历史的后果。在牛乳或乳清阶段施加热处理通过决定乳清蛋白变性状态、聚集体尺寸和微滤过程中吸附到MFGM碎片的倾向，强烈影响WPPC的组成。这些界面组装体直接影响膜过滤性能、污染行为和后续旨在富集天然MFGM蛋白或极性脂质的分级分离策略的效率。此外，WPPC的高磷脂含量增加了脂质氧化的脆弱性，可进一步驱动蛋白质二次修饰并降低功能完整组分的回收率。因此，WPPC不能简单视为乳MFGM组成的浓缩快照，而是反映了热、机械和分离过程的整合历史。
防止非MFGM蛋白结合的策略
为保护MFGM完整性并改善其分离，研究人员探索了多种方法。一种方法是在分离前使用微滤从全脂乳中去除非MFGM蛋白，可提高所得MFGM粉末的纯度。研究表明，使用1.4 μm孔径膜可将乳蛋白从脂肪相中去除88%，脂肪损失仅3%。加工顺序对MFGM蛋白组成有重要影响：先巴氏杀菌后过滤会增加β-LG与MFGM的关联并降低PAS 6/7水平，而先过滤后巴氏杀菌则蛋白组成基本不变。化学添加剂方面，用8 M尿素（破坏氢键）或2 M NaCl（抑制静电和疏水相互作用）处理原料乳可减少β-LG与MFGM的关联，而0.2%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）可完全阻止这种关联，其机制是SDS结合疏水蛋白区域，赋予净负电荷产生静电排斥并破坏β-LG与MFGM蛋白之间的硫醇-二硫键交联。然而，目前尚无方法在工业规模上被证明完全有效。
热诱导转化对WPPC和目标化合物分离的影响
WPPC因其营养密集的组成和丰富的MFGM相关生物活性物质而成为有价值的乳品副产物。美国乳制品协会（American Dairy Products Institute，ADPI）最近为用于婴儿配方食品的WPPC引入了组成标准，规定蛋白质最低50%（干基）、脂肪12%、总磷脂4%。热加工条件显著影响WPPC中MFGM相关蛋白和极性脂质的丰度、结构完整性和可回收性。在磷脂提取方面，研究人员探索了多种策略：超临界二氧化碳（SC-CO2）和乙醇萃取中，初始物料的pH显著影响磷脂产率，鞘磷脂在pH 7.4的第二次萃取阶段回收浓度较高；乙醇浓度和温度优化研究发现，80°C下90%乙醇可实现最大脂质回收率（40.7%）、磷脂回收率（58.1%）和磷脂含量（45.8%）；使用SC-CO2和乙醇作为共溶剂，在35.0 MPa、40°C、15%乙醇条件下获得最大磷脂产率26.26 g/100 g脂肪；乙醇和分级结晶方法可有效分离乙醇可溶性极性脂质与结晶脂质类别，最终残渣含38.6%极性脂质。
五、讨论与结论
该综述的核心论点在于：热加工对MFGM的重塑是一个多机制、多组分协同的复杂过程，涉及共价和非共价相互作用的网络。β-LG的Cys121是热诱导与MFGM相互作用的关键驱动因素，但整个过程受多种膜蛋白和乳蛋白的调控。脂质层面的改变不仅是加热的结果，更是后续蛋白聚集和界面复合物形成的使能事件。对于WPPC而言，其高蛋白-脂质界面浓度使其对上游热历史尤为敏感，加工条件的细微差异可能被放大并影响最终产品的组成和功能。现有文献中许多从全脂乳或稀奶油得出的观察结果被隐式地外推至乳清衍生原料，但这种外推在WPPC这类基质中日益缺乏直接证据支持。综述强调，需要更多直接针对WPPC体系的研究来验证这些机制的外推有效性。在应用层面，优化热处理时机和使用添加剂是当前减少蛋白聚集的主要策略，但尚无方法在工业规模上完全有效。WPPC作为磷脂结合营养素（尤其是胆碱）递送基质的潜力正在显现，理解热加工如何改变这些生物活性组分的结构组织、可及性和稳定性，对于配料功能性和人类健康应用都日益重要。未来研究应聚焦于开发更高效、可扩展的分离技术，以在保持MFGM生物活性的同时提高高纯度组分的回收率，从而推动下一代功能性乳品配料的开发。
