《Nature Communications》：CpG hypermethylation and WNT/AP-1 cooperativity define the epigenetic landscape and a clinical subgroup of high-risk pediatric adrenocortical carcinoma
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儿童肾上腺皮质肿瘤（pediatric adrenocortical tumors, pACTs）是罕见的、临床异质性强的肿瘤，其预后难以预测，治疗选择有限。研究人员通过对214例儿童肾上腺皮质肿瘤进行整合多组学分析，结合DNA甲基化谱（DNA methyla
儿童肾上腺皮质肿瘤（pediatric adrenocortical tumors, pACTs）是罕见的、临床异质性强的肿瘤，其预后难以预测，治疗选择有限。研究人员通过对214例儿童肾上腺皮质肿瘤进行整合多组学分析，结合DNA甲基化谱（DNA methylation profiling）、转录组学（transcriptomics）、染色质可及性（chromatin accessibility）和空间去卷积（spatial deconvolution），识别出四个不同的风险组。一个高危亚组的特征为CpG岛高甲基化（CpG island hypermethylation）、染色体不稳定性（chromosomal instability）和极差的生存率。这些肿瘤表现出WNT信号通路与激活蛋白-1（activator protein-1, AP-1）转录程序的转录共激活，并呈现肾小球带（zona glomerulosa, zG）与束状带/网状带（zona fasciculata/reticularis, zF/zR）样细胞的均衡混合。空间分析揭示肾小球带细胞作为WNT信号枢纽，驱动细胞间串扰（intercellular crosstalk）。机制上，组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor, HDACi）恩替诺特（entinostat）可逆转启动子甲基化、沉默AP-1活性，并在肿瘤模型中诱导凋亡重编程。这些发现建立了风险分层的分子框架，并识别出可操作的治疗靶点，为研究这一分子图谱尚未明确的儿童恶性肿瘤提供了重要资源。
**论文解读文章**
**一、研究背景与科学问题**
儿童肾上腺皮质肿瘤（pediatric adrenocortical tumors, pACTs）是一类罕见但生物学行为复杂、临床异质性显著的内分泌恶性肿瘤。尽管大多数pACTs在婴幼儿期发病并表现为内分泌症状，但其生物学行为从惰性到高度侵袭性不等，转移性病例的生存率仅为15.6%。临床上，既存在过度治疗，也存在治疗不足的问题。现有的组织病理学分类——包括Wieneke评分、五项评分、COG分期及ps-GRAS评分——虽用于指导治疗，但在预测预后方面常力不从心，尤其是在局部晚期或交界性肿瘤中。在遗传层面，TP53胚系变异（尤其是巴西南部的R337H founder突变）是pACT的标志性事件，但约有25%的肿瘤存在体细胞TP53突变。IGF2过表达（通过11p LOH）亦常见，但不足以解释广泛的临床异质性。虽然针对成人肾上腺皮质癌（adrenocortical carcinoma, ACC）的TCGA研究已揭示关键基因组和表观遗传驱动因素（如CIMP表型和全基因组加倍），但pACTs的相应分子框架仍然缺乏。既往基于TP53、ATRX突变状态或DNA甲基化类别的亚组分类研究受限于队列规模小和地域局限。因此，pACTs迫切需要改进的风险分层工具以及对驱动其侵袭性生物学行为的分子机制的深入理解。
**二、研究目的与主要内容**
该研究旨在通过整合多组学分析，建立pACTs的分子分型框架，识别与临床结局相关的生物学亚组，并探索潜在的治疗靶点。研究人员整合了来自德国恶性内分泌肿瘤（MET）登记处的109例pACTs（包括60例pACC、35例pACA、14例pUMP），并纳入Clay等人（n=60）和Bueno等人（n=57）已发表的队列，最终形成214例pACTs和12例健康肾上腺皮质对照样本的联合队列。研究整合了DNA甲基化谱、批量转录组、单核RNA测序（snRNA-seq）、单核ATAC测序（snATAC-seq）以及空间转录组学数据。
**三、主要技术方法**
该研究运用了多项关键技术：（1）基于Illumina Infinium Human Methylation EPIC芯片的全基因组DNA甲基化谱分析及一致性聚类（consensus clustering）；（2）单核RNA测序（snRNA-seq）和单核ATAC测序（snATAC-seq）用于解析肿瘤细胞组成和染色质可及性；（3）基于非负矩阵分解（non-negative matrix factorization, NMF）的转录程序分解；（4）10x Genomics Visium HD平台的空间转录组学分析；（5）基于DNA甲基化数据的随机森林分类器开发；（6）利用成人ACC细胞系（H295R和CU-ACC1）及原代pACC短期培养进行药物敏感性筛选和功能验证；（7）免疫组化（immunohistochemistry, IHC）评估CTNNB1蛋白定位。
**四、主要研究结果**
**1. DNA甲基化分析识别出四个具有预后意义的亚组**
基于DNA甲基化谱的无监督一致性聚类，研究识别出四个分子亚组：高危组（HR，n=36）和三个低危组（LR1，n=104；LR2，n=34；LR3，n=40）。HR组的5年总生存率仅为25%，显著低于低危组（LR1: 91%，LR2: 96%，LR3: 97%）。与传统的组织病理学分类相比，DNA甲基化分型在预后分辨力上更具优势，时间依赖性AUC从1年时的0.79增至10年时的0.92，而Ki-67指数、Wieneke评分、COG-IPACTR分期及ps-GRAS评分的预测性能均不及该分型。在COG/IPACTR 2-3期等临床难判病例中，DNA甲基化分型的10年AUC达到0.93。研究还开发了基于随机森林的分类器，经嵌套交叉验证准确性达0.934，AUC为0.989，误分类率为0.066。
**2. 高危亚组表现出CpG岛高甲基化和染色体不稳定性**
HR亚组表现出显著的CpG岛高甲基化（中位甲基化水平0.62），与LR1（0.2）差异显著，但与成人ACC的CIMP-high亚组（0.75）无显著差异。甲基化来源的拷贝数分析显示，HR肿瘤存在高负担的复发性染色体改变，包括MYC、CDK4、MDM2、AURKC等癌基因扩增，以及BRCA2、CHEK2、TP73等抑癌基因缺失。相比之下，LR2肿瘤基因组高度稳定。在遗传改变方面，LR2的TP53胚系变异频率（13.3%）显著低于其他亚组（50.0%-65.8%），而LR2的CTNNB1体细胞突变频率（76.2%）则显著高于其他亚组。
**3. 单核RNA测序显示pACTs模拟肾上腺皮质的生理性分区**
对18个pACT样本的75,515个单核转录组分析显示，肿瘤细胞的转录谱与生理性肾上腺皮质高度相似，鉴定出zG样、zF/zR样（两个亚群）、循环肿瘤细胞及微环境细胞群。拟时间分析提示从zG样细胞向zF/zR样细胞的分化轨迹，模拟健康肾上腺皮质的分化模式。HR肿瘤表现出zG-和zF/zR样细胞状态的近乎均衡分布，Shannon多样性指数最高（1.01），提示更广的分化谱和更高的细胞可塑性。微环境分析显示HR肿瘤中巨噬细胞和淋巴细胞显著耗竭，提示免疫抑制性微环境。
**4. NMF转录元签名揭示功能异质性**
NMF分解识别出七个共享的转录元签名（metasignatures），包括细胞周期激活、类固醇生成、应激与缺氧、类固醇生成应激反应、耐药与分化稳定、免疫调节及细胞外基质结构完整性。这些元签名在不同亚组中分布差异显著：HR肿瘤特异性地在zG样细胞中富集细胞周期激活程序；LR3富集类固醇生成程序；HR肿瘤中多种元签名共存，提示簇间通讯可能驱动肿瘤进展。
**5. 验证队列和多组学分析确认亚组特异性调控程序**
在独立验证队列中，细胞类型和元签名的比例分布与原队列高度一致。整合snRNA-seq和snATAC-seq的多组学分析显示，HR肿瘤在TCF7L2和AP-1结合基序上表现出显著增强的染色质可及性。染色质免疫沉淀分析（ChromVAR）证实HR肿瘤中CTNNB1和AP-1复合物的活性评分最高。LR2虽显示WNT激活（核CTNNB1定位），但缺乏AP-1活性；LR1则仅显示AP-1活性而无WNT激活。因此，WNT与AP-1的共激活是HR亚组的独特调控特征。
**6. 空间转录组学揭示高危肿瘤的组织结构改变**
Visium HD空间转录组学分析显示，低危肿瘤表现出区室化结构，肿瘤与基质区域界限清晰；而HR肿瘤则呈现无序结构，肿瘤细胞与免疫、基质成分广泛交织，失去明确的区室边界。Moran's I空间自相关分析显示HR肿瘤中成纤维细胞和zG样肿瘤细胞呈现更强的空间聚集。PROGENy通路活性推断显示HR肿瘤中WNT通路活性最高。
**7. HDAC抑制剂恩替诺特逆转高危表观遗传特征并诱导凋亡**
药物筛选显示，I类HDAC抑制剂恩替诺特在HR pACC短期培养中表现出最强的抗增殖效果（IC50约1 μM）。在H295R和CU-ACC1两个ACC细胞系中，恩替诺特处理导致启动子相关CpG位点显著去甲基化（包括CASP8、CDKN2A、BCL2L1等促凋亡基因座），下调AP-1组分（FOS、JUND、JUNB）表达，上调类固醇生成基因（如STAR），并剂量依赖性地增加促凋亡基因表达和凋亡细胞比例。血清饥饿/再刺激实验证实AP-1通路在这两个细胞系中具有功能活性。
**五、讨论与结论**
该研究建立了pACTs的分子分型框架，证明DNA甲基化分型在预后判断上优于现有临床和组织病理学评分系统。HR亚组以CpG岛高甲基化、WNT与AP-1转录程序共激活以及免疫抑制性微环境为特征。WNT-AP-1协同作用作为一种此前在TP53缺陷肿瘤中未被描述的调控机制，可能驱动HR肿瘤的侵袭性生物学行为。研究人员认为，HR肿瘤可能劫持了发育过程中的WNT信号通路以维持增殖性、未分化状态，而AP-1则作为关键辅因子促进转录可塑性和表型适应。研究还提示HDAC抑制剂（如恩替诺特）可能通过逆转异常甲基化、沉默AP-1驱动的致癌程序并恢复分化潜能，成为HR-pACT的潜在治疗策略。
**结论部分翻译**：总之，该研究识别出具有临床和生物学意义的pACTs亚组，并揭示WNT-AP-1协同转录网络和CpG岛高甲基化升高是HR疾病的定义性标志。据研究人员所知，WNT与AP-1的协同作用此前尚未与TP53缺陷肿瘤相关联，因此所呈现的数据为具有相同遗传背景的其他肿瘤类型（如TP53缺陷的肉瘤或癌）的进一步研究提供了参考。该数据集和分析为未来肾上腺皮质肿瘤研究提供了全面资源，支持风险适应的临床决策，并确定了侵袭性pACC中表观遗传治疗策略的潜在机会。
