《Foods》：Antifungal Efficacy of Selenium Microparticles Biosynthesized by Lysinibacillus sphaericus Against Citrus Postharvest Blue and Green Molds: Mechanistic Insights
编辑推荐：
由Penicillium italicum引起的柑橘采后蓝霉病和由P. digitatum引起的绿霉病是导致果实腐烂和经济损失的主要病害。日趋严重的杀菌剂抗药性问题以及对化学杀菌剂安全性的担忧，使得开发替代防控策略成为迫切需求。本研究利用Lysinibacil
由Penicillium italicum引起的柑橘采后蓝霉病和由P. digitatum引起的绿霉病是导致果实腐烂和经济损失的主要病害。日趋严重的杀菌剂抗药性问题以及对化学杀菌剂安全性的担忧，使得开发替代防控策略成为迫切需求。本研究利用Lysinibacillus sphaericus N30生物合成了硒微粒（SeMPs），并通过扫描电子显微镜-能量色散X射线光谱（SEM-EDS）、X射线衍射（XRD）、拉曼光谱和动态光散射（DLS）对其进行了表征。研究人员采用接种后6 h处理与共接种处理两种方式评估了N30来源SeMPs对柑橘采后病害的防治效果，并通过检测活性氧（ROS）积累、膜完整性、胞外电导率和胞内大分子泄漏进一步研究了其抗真菌作用。N30来源的SeMPs主要为球形，Z-平均流体动力学直径为656.5 nm，多分散指数（PDI）为0.274。EDS鉴定Se为主要元素，XRD和拉曼分析支持其主要形成无定形元素硒。体内试验表明，在P. italicum共接种处理中，640 mg·L?1 SeMPs可完全阻止蓝霉病发生，而1280 mg·L?1在两种处理模式下均可完全抑制蓝霉病。由P. digitatum引起的绿霉病在1280–2560 mg·L?1时被完全抑制，共接种处理通常表现出优于接种后处理的效果。SeMPs暴露与两种病原菌胞内ROS积累增加、膜完整性丧失、胞外电导率升高以及胞内大分子泄漏相关。P. italicum对SeMPs相关膜扰动的敏感性高于P. digitatum，这与果实试验中其更高的敏感性一致。这些发现表明，L. sphaericus N30产生的生物源SeMPs有望作为基于硒的抗真菌材料用于柑橘采后蓝霉病和绿霉病的防控。
柑橘采后病害的绿色防控是当前水果保鲜领域的研究热点。柑橘作为全球广泛种植和贸易的重要水果，在采后运输和贮藏过程中极易受到病原真菌侵染，其中由意大利青霉（Penicillium italicum）引起的蓝霉病和指状青霉（Penicillium digitatum）引起的绿霉病是最常见且破坏性最强的采后病害，可造成严重果实腐烂和经济损失，相关损失在柑橘采后总损失中占比可高达90%。目前化学杀菌剂仍是主要防控手段，但长期不合理使用已导致病原菌对苯并咪唑类、脱甲基抑制剂类（DMI）和醌外部抑制剂类（QoI）等多种主流杀菌剂产生抗药性，同时农药残留、环境污染和食品安全风险日益突出。因此，开发高效、安全、环境友好的替代防控技术成为柑橘采后保鲜领域的迫切需求。
硒是重要的必需微量元素，其元素态微粒的抗菌活性受到广泛关注。已有研究主要集中在硒纳米颗粒（SeNPs）上，但根据美国国家纳米技术倡议和国际标准化组织的定义，纳米尺度通常对应约1–100 nm，因此显著大于该尺度的硒微粒（SeMPs）应区别于常规SeNPs。文献中已有平均粒径约475–900 nm的SeMPs表现出抗菌和抗氧化活性的报道，然而与SeNPs相比，SeMPs的抗微生物特性尤其是针对采后植物病原真菌的研究仍十分有限。研究人员前期从我国四川省宜宾市屏山县老君山富硒土壤中分离获得一株耐亚硒酸盐的赖氨酸芽孢杆菌Lysinibacillus sphaericus N30，该菌株可高效还原亚硒酸盐并生成球形硒颗粒，表征后确认其粒径超过常规纳米尺度，故命名为硒微粒（SeMPs）。本研究旨在利用该菌株生物合成SeMPs，系统表征其形貌、元素组成和粒径分布，评估其对柑橘采后蓝霉病和绿霉病的防治效果，并从菌丝形态、膜和细胞壁完整性、胞内活性氧（ROS）积累、胞外电导率及胞内成分泄漏等方面解析其抗真菌机制，为硒基采后病害防控材料的开发提供依据。
研究采用的主要技术方法包括：以L. sphaericus N30（GenBank登录号PP053464，分离自四川宜宾富硒土壤）在含5 mmol·L
?1亚硒酸钠的LB培养基中发酵还原硒，经细胞破碎、SDS洗涤、有机溶剂处理和冷冻干燥制备纯化SeMPs；利用SEM-EDS、XRD、拉曼光谱和DLS表征材料；采用微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MFC）；在Orah柑橘（Citrus reticulata cv. Orah，采自四川宜宾）果实上设置接种后6 h处理与共接种处理两种模式评估防治效果；通过SYTOX Green染色、Calcofluor White染色和DCFH-DA探针分别检测膜完整性、细胞壁完整性和ROS水平；通过电导率仪和紫外分光光度法测定胞外电导率及260 nm和280 nm吸光度以评估核酸和蛋白质泄漏。
3.1 SeMPs的形态、元素组成、结构与粒径表征：SEM显示菌株N30为典型杆状形态，在含亚硒酸盐培养条件下细胞表面附着大量颗粒状沉积物，纯化后颗粒以球形为主。EDS分析表明Se为最主导元素，占检出质量73.59%，同时含C（24.02%）和O（2.38%）。XRD图谱在约26.81°和52.80°处呈现宽弥散衍射特征而无尖锐Bragg峰，拉曼光谱在240 cm
?1区域出现对应Se–Se振动模式的主峰，说明N30来源SeMPs主要为无定形元素硒。DLS测定显示悬浮液粒径分布主要集中在约531.93 nm处，Z-平均流体动力学直径为656.5 nm，PDI为0.274，据此将材料归类为SeMPs而非常规SeNPs。
3.2 SeMPs对柑橘病原菌的生长抑制及MIC/MFC分析：通过微量肉汤稀释法和PDA恢复培养测定，SeMPs对P. digitatum和P. italicum均表现出浓度依赖性生长抑制作用，两者MIC和MFC均为320 mg·L
?1，表明该浓度下SeMPs不仅完全抑制生长且能防止病原菌恢复，体现杀真菌效果。
3.3 果实防治效果：果实试验显示，两种处理模式下SeMPs均浓度依赖地降低发病率和病斑直径。P. italicum共接种处理在640 mg·L
?1时发病率降为0%，1280 mg·L
?1时两种处理均完全抑制蓝霉病；P. digitatum在1280 mg·L
?1及以上浓度时两种处理均完全防控绿霉病。总体上共接种处理效果优于接种后6 h处理，且P. italicum对SeMPs的敏感性高于P. digitatum。
3.4 SeMPs处理对菌丝表面形态的影响：SEM观察显示，未处理菌丝表面光滑饱满，320 mg·L
?1 SeMPs处理后两种菌丝均出现明显皱缩，2560 mg·L
?1时皱缩加剧，菌丝几乎完全塌陷并出现局部凹陷，说明SeMPs可有效破坏菌丝形态且效应浓度依赖。
3.5 SeMPs处理对细胞膜完整性的影响：SYTOX Green染色显示，SeMPs处理后两种病原菌绿色荧光显著增强且浓度依赖，2560 mg·L
?1时荧光强度最高，表明SeMPs破坏菌丝膜完整性并增加膜通透性。P. italicum在中间浓度（640和1280 mg·L
?1）时荧光响应强于P. digitatum。
3.6 SeMPs处理对菌丝细胞壁的影响：Calcofluor White染色显示，SeMPs处理后两种病原菌细胞壁结合成分的蓝紫色荧光随浓度升高而减弱，2560 mg·L
?1时荧光强度最低，说明SeMPs扰乱了与CFW结合的多糖类细胞壁成分，细胞壁完整性受损。
3.7 SeMPs处理对活性氧水平的影响：DCFH-DA荧光探针检测显示，对照组菌丝几乎无绿色荧光，SeMPs处理后荧光随浓度增加而明显增强，2560 mg·L
?1时大部分菌丝呈强荧光，表明SeMPs诱导两种病原菌胞内ROS积累，且在高浓度下P. italicum的ROS信号强于P. digitatum。
3.8 SeMPs处理对胞外电导率的影响：胞外电导率测定显示，SeMPs处理后两种病原菌的胞外电导率在前1 h内快速上升后趋缓，高浓度（如2560 mg·L
?1）处理组电导率显著高于对照组，说明SeMPs早期即可破坏膜功能并导致胞内电解质外流。
3.9 SeMPs处理对核酸和蛋白质泄漏的影响：通过测定胞外上清液260 nm和280 nm吸光度，发现SeMPs处理浓度越高、时间越长，两种病原菌的核酸和蛋白质泄漏程度越大，2560 mg·L
?1处理组在9 h时OD260和OD280均显著高于对照组，表明膜通透性升高导致胞内大分子外泄。
讨论部分指出，L. sphaericus N30产生的SeMPs粒径处于数百纳米范围，与文献中已报道的具有抗菌活性的SeMPs粒径相符，应被视作该生物合成体系的具体特征而非异常尺寸。SeMPs对柑橘采后病害的防控效果与施用浓度和施用时机密切相关，共接种处理较接种后处理的优势说明病原菌定殖早期施用更有利于控制病害。本研究观察到的ROS积累、膜通透性增加、胞外电导率升高以及胞内核酸和蛋白质泄漏共同出现，提示氧化应激与膜功能障碍是SeMPs暴露过程中相互关联的细胞反应，但从现有数据尚不能确定二者之间的因果和时间顺序。此外，当前SeMPs制备流程涉及微生物培养、细胞破碎、SDS辅助洗涤、有机溶剂处理、透析和冻干等多步骤环节，大规模生产受到限制，且商业浸果处理需要大量材料，果实品质指标和硒残留迁移尚未量化评估，需后续进行安全性验证和工艺优化。
研究结论可翻译如下：本研究证明，Lysinibacillus sphaericus N30来源的生物源硒微粒对意大利青霉（Penicillium italicum）和指状青霉（P. digitatum）具有抗真菌活性，在受控实验条件下能够抑制柑橘采后蓝霉病和绿霉病的发展。N30来源的SeMPs的抗真菌作用与菌丝形态和细胞壁相关结构的显著改变、膜通透性增加、胞内活性氧（ROS）积累、胞外电导率升高以及胞内成分泄漏有关，表明膜功能障碍和氧化应激是SeMPs暴露的重要细胞反应。P. italicum和P. digitatum之间的敏感性差异进一步提示物种依赖性响应，但氧化应激、膜扰动和胞内泄漏之间的因果关系仍有待阐明。总体而言，这些发现为N30来源的SeMPs作为柑橘采后抗真菌材料的潜在应用提供了实验室规模的概念验证。在考虑商业化采后应用之前，仍需进一步研究优化生产和施用策略，并系统评估果实品质、硒残留与迁移、毒理学安全性和法规符合性。
