《International Journal of Molecular Sciences》：Terminal V5 Tagging of All Four Newcastle Disease Virus Structural Proteins Is Compatible with Particle Formation in Sf9 Cells
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新城疫病毒样颗粒（Newcastle disease virus-like particles, NDVLPs）由基质蛋白（matrix protein, M）、核蛋白（nucleoprotein, NP）、融合蛋白（fusion protein, F）和血凝
新城疫病毒样颗粒（Newcastle disease virus-like particles, NDVLPs）由基质蛋白（matrix protein, M）、核蛋白（nucleoprotein, NP）、融合蛋白（fusion protein, F）和血凝素–神经氨酸酶蛋白（hemagglutinin-neuraminidase protein, HN）组装而成。末端表位标签使这些蛋白易于检测，但可能干扰装配，而关于这四种蛋白能耐受多大程度的末端修饰，目前尚缺乏充分记载。研究人员使用八个pFastBac Dual供体质粒生成重组杆状病毒，并在Sf9细胞中生产了十二种NDVLP变体，通过蔗糖梯度超速离心进行纯化。从全部十二种制备物中均回收到了颗粒样结构。蛋白质印迹法（Western blotting）证实了天然蛋白和V5标签蛋白的产生及其在颗粒组分中的共纯化；透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）显示，每种制备物都含有包膜、近似球形的颗粒，测得直径范围为55至150 nm（中位数90 nm），外观与天然NDV相似。在β-葡萄糖醛酸酶（beta-glucuronidase）对照制备物中也存在类似大小的颗粒，因此颗粒的归属取决于各组分的蛋白组成，而非仅凭形态学。无论哪种结构蛋白携带标签，颗粒均能形成，包括一个同时标记所有四种蛋白的变体。在所测试的条件下，19个氨基酸残基的末端插入在每个被检测的四个位置上均与NDVLP的回收相容。
新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）是一种包膜单股负链RNA病毒，感染多种禽类，引起高度传染性的新城疫，造成全球养禽业经济损失。NDV向人类传播罕见且症状轻微，这使NDV来源的病毒样颗粒（virus-like particles, VLPs）成为安全的疫苗研究平台。VLP由一种或多种病毒结构蛋白自组装形成，模拟天然病毒粒子的大小与构象，能高效诱导免疫应答。已有研究表明，NDV的基质蛋白（matrix protein, M）是颗粒出芽所必需且足够的，而含有核蛋白（nucleoprotein, NP）、M、血凝素–神经氨酸酶蛋白（hemagglutinin-neuraminidase protein, HN）和融合蛋白（fusion protein, F）的颗粒可从禽源细胞释放。然而，以往研究大多关注单个重组蛋白或外源抗原，对于多个结构蛋白同时被末端表位标记时NDVLP装配行为是否受影响，尚无系统记载。因此，本研究旨在系统调查在四个结构蛋白的特定末端位置插入短表位标签（V5）后，颗粒形成是否仍能发生。
研究人员利用八种pFastBac Dual供体质粒，通过Bac-to-Bac杆状病毒表达载体系统（baculovirus expression vector system, BEVS）在Sf9昆虫细胞中生成重组杆状病毒，共表达天然或V5标记的M、HN、F和NP蛋白，生产了十二种NDVLP变体，并通过蔗糖梯度超速离心纯化。所有十二种制备物中均回收到了颗粒样结构。Western blotting证实天然和V5标记蛋白均正确表达并共纯化于颗粒组分中。透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）显示所有制备物均含有包膜、近似球形的颗粒，直径范围55–150 nm，中位数90 nm，与天然NDV外观相似。值得注意的是，无论哪种结构蛋白携带V5标签，甚至当四种蛋白同时被标记时，颗粒均能形成。该结果表明，在所测试条件下，19个氨基酸残基的末端插入在这四个位置均与NDVLP回收兼容。
本研究采用的关键技术包括：基于Bac-to-Bac的杆状病毒表达载体系统在Sf9细胞中共表达目标蛋白，利用双启动子（p10和PH）实现两个基因的同步表达；通过不连续蔗糖梯度超速离心和等密度梯度超速离心纯化颗粒；使用Western blotting分析蛋白组成；使用透射电子显微镜观察形态并测量直径。所用基因来自NDV LaSota株（GenBank登录号AY845400.2）的M、HN、F、NP编码序列，经密码子优化后化学合成；Sf9细胞系来自实验室收藏。
2.1 天然和嵌合NDV蛋白产生的确认。通过抗NDV多克隆抗体和抗V5单克隆抗体的Western blotting分析，研究人员确认了未修饰和V5标记的M、HN、F、NP蛋白在Sf9细胞中的表达。嵌合蛋白的条带迁移位置与预期相符，19残基标签添加约2 kDa。F和HN的糖基化异质性也得以保留。该实验证实了BEVS成功生产了全部天然和嵌合结构蛋白。
2.2 纯化NDVLP变体的表征。对纯化样品同时进行蛋白组成和形态学分析。
2.2.1 蛋白组成分析。Western blotting结果显示，在每种NDVLP制备物中，预期的病毒蛋白均被共纯化；抗V5信号仅存在于含有标签蛋白的制备物中，而在仅含天然蛋白的制备物和β-葡萄糖醛酸酶（GUS）阴性对照中缺失。由于上样量基于体积且抗体稀释度不同，条带强度无法用于比较蛋白相对含量。
2.2.2 纯化制备物的形态学分析。TEM负染色显示，全部十二种变体均含有与天然NDV粒子外观相似的包膜球形颗粒，直径55–150 nm，中位数90 nm。GUS对照中虽也出现了类似大小的颗粒，但其形态为折叠的杯状轮廓，与NDVLP的封闭凸面轮廓不同，且对照中未检测到NDV或V5信号，因此颗粒的鉴定依赖于与NDV结构蛋白共纯化的组分，而非仅靠形态学。
讨论部分指出，BEVS是成熟的蛋白制造平台，能够在昆虫细胞中生产具有复杂翻译后修饰的重组蛋白，但昆虫与哺乳动物的糖基化模式差异可能影响抗体的亲和检测。V5末端标签提供了一种不依赖抗体识别的替代检测策略。本研究的局限性包括：未将特定蛋白直接归属于单个颗粒，条带强度不具定量性，且每个变体仅生产纯化了一次，但蛋白表达的可重复性已在3–4次独立实验中验证。结论：在测试条件下，M、HN、F、NP四种结构蛋白的19残基末端插入均与NDVLP颗粒形成兼容，包括同时标记全部四种蛋白的变体；更大的标签插入是否耐受仍待研究。
