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针叶树是森林生态系统的重要组成部分；然而，由于基因组复杂性，其生殖发育研究仍然较少。本文呈现了一个时间分辨的空间转录组（spatial transcriptomics, ST）图谱：涵盖3个时间点、88个组织切片，来自野生型挪威云杉（Picea abies）正
针叶树是森林生态系统的重要组成部分；然而，由于基因组复杂性，其生殖发育研究仍然较少。本文呈现了一个时间分辨的空间转录组（spatial transcriptomics, ST）图谱：涵盖3个时间点、88个组织切片，来自野生型挪威云杉（Picea abies）正在发育的生殖芽和营养芽，以及acrocona突变体的过渡芽。通过研究其不同的时空基因表达动态，研究人员鉴定了营养向生殖转变过程中活跃的分子过程及其在芽中的特定空间结构域。研究人员还鉴定并实验表征了一个MADS-box基因DAL55（DEFICIENS AGAMOUS LIKE 55），该基因在侧生器官发育过程中活跃。此外，研究人员揭示了裸子植物与被子植物YABBY基因之间的进化关系，这些基因负责复杂结构中的内层或外层细胞层。总体上，该时空图谱鉴定了与植物生殖器官相关的基因、通路和进化关系，为研究针叶树生殖发育提供了宝贵的资源。
**针叶树生殖发育的时空转录组学研究——挪威云杉球果发育调控机制解读**
针叶树是北方森林生态系统的核心组成部分，在生态、历史、文化和经济中具有重要地位。然而，大多数针叶树种世代周期长，严重制约了遗传增益和育种效率，进而影响旨在增强生长、保护生物多样性和提高气候适应性的针叶树育种项目。因此，解析影响球果形成和发育的遗传因素，对于改善现有育种计划、缓解气候变化对北方森林的影响具有重要意义。针叶树属于裸子植物，其生殖结构形成于独立的芽分生组织上，通常称为花粉球果和种子球果，与被子植物两性花在形态上存在根本差异。然而，进化发育（Evo-Devo）研究结果表明，调控雌雄器官特性的遗传机制在被子植物和裸子植物间存在保守性，种子球果发生的启动可能受年龄依赖开花通路中保守元件及裸子植物特有MADS-box基因家族成员的共同调控。但由于针叶树基因组高度复杂，开展正向或反向遗传学功能研究极其困难，因此获取定量且具有空间分辨率的基因表达信息对推进针叶树生殖遗传学研究至关重要。此前，此类信息主要依赖低通量、需预先设计探针的mRNA原位杂交（ISH）技术，难以全面揭示复杂调控机制。2017年，研究人员已证明空间转录组（ST）技术可应用于P. abies种子球果切片，为规模化解析基因表达模式开辟了新途径。本研究即在此背景下开展，旨在构建挪威云杉生殖结构发育的时空基因表达图谱，揭示其生殖发育的分子调控机制。
研究人员应用空间转录组技术（Visium，10× Genomics），以55微米分辨率对P. abies野生型营养芽和种子球果以及自然突变体acrocona的过渡芽进行剖析。样本采集于2019年8月中旬、9月中旬和10月中旬三个关键发育时间点（部分种子球果样本来自2018年和2020年），取样地点包括瑞典乌普萨拉的R?rby种子园和H?gadalen–N?sten自然保护区。共收集29个芽原基，获得88个组织切片的空间转录组数据，并综合运用扫描电子显微镜（SEM）、mRNA原位杂交（ISH）、DNA亲和纯化测序（DAP-seq）、酵母单杂交（Y1H）、Sanger测序、逆转录定量PCR（RT-qPCR）、STdeconvolve细胞类型反卷积、Monocle3拟时分析及hdWGCNA共表达网络分析等关键技术手段，对形态差异、基因表达动态、细胞类型组成、发育轨迹及基因调控网络进行了系统研究。
**P. abies野生型和acrocona突变体球果呈现不同的形态发育**
通过宏观成像、SEM和明场显微镜观察，研究人员鉴定出种子球果、营养芽和acrocona过渡芽在早幼芽发育中经历三个 distinct 生长阶段：第1阶段茎尖分生组织（SAM）膨大形成顶端圆顶，第2阶段侧生器官向顶发生（营养芽形成针叶原基，球果原基形成不育苞片和珠鳞），第3阶段侧生器官在组织水平继续分化直至冬季休眠。acrocona过渡芽在第2阶段初期表现为营养芽特性，但第2阶段末期发生形态转变，基部保持营养发育，顶端转而产生由苞片支撑的珠鳞样结构，转变程度不一，从少数苞片样针叶到形成可产生可育种子的功能性珠鳞。
**P. abies野生型和acrocona突变体球果时空发育图谱**
研究人员对88个组织切片进行ST分析，过滤后获得28,636个点（spot），检测到24,231个基因，三个芽类型间平均每个点的独特分子标识符（UMI）数在同一数量级，转录捕获均一，可进行比较分析。此外，还开发了交互式开源ShinyApp供科学界探索所有组织切片的空间基因表达模式和空间细胞状态注释。
**空间转录组揭示跨芽类型保守的时空模式**
通过无监督降维和聚类分析，鉴定出16个distinct clusters，其中14个簇映射到特定组织结构域，分为髓、维管、侧生器官原基（LOP）和侧生器官分化（LOD）四个宏组织域。髓部簇富集金属硫蛋白基因；维管簇包含前形成层、木质部和韧皮部组织标记基因；LOP簇中赤霉素调控6-like基因高表达；LOD簇表达轴向调节因子YABBY C和富含甘氨酸细胞壁结构蛋白基因。分析还发现了多个先前未知的空间定位基因，可作为后续基因注释的起点。
**细胞类型反卷积增强空间分辨率**
应用STdeconvolve参考-free反卷积软件对10月芽原基进行细胞类型预测，分别在种子球果、acrocona过渡芽和营养芽原基中鉴定出15、20和11种转录组定义细胞类型。种子球果中鉴定出表皮特异性细胞类型EL1-2、髓P1-3、前维管PV1-5、侧生器官LO1-4及顶端分生组织M1。基因本体（GO）分析显示，覆盖珠鳞部分的LO3富集极性与花发育相关条目，LO1富集代谢过程与细胞命运决定条目。MADS-box基因DAL2（DEFICIENS AGAMOUS LIKE 2）作为LO3标记基因，mRNA-ISH确证其仅表达于珠鳞。对苞片和珠鳞斑点进行差异表达分析，鉴定出719个差异表达基因，包括珠鳞标记基因PaAS2和苞片标记基因PaRTFL9等。
**鉴定负责侧生器官发育的MADS-box基因**
通过与全长PaSPL1转录本共表达分析，鉴定出491个差异表达基因，其中包括MADS-box基因DAL14、DAL1及先前未表征的部分MADS-box基因DAL55。克隆测序证实DAL55具有保守的MADS-box和K结构域，系统发育分析将其定位在SHORT VEGETATIVE PHASE（SVP）分支。DAP-seq实验显示PaSPL1可结合DAL14、PaSPL1、DAL55的5'端上游区域及DAL1的第一个内含子区域。酵母单杂交实验证实PaDAL1和PaSPL1均可直接结合PaSPL1启动子，支持PaSPL1反馈调节环和DAL1介导的PaSPL1上调模型。基于此提出发育信号互作模型：miR156/529-PaSPL1-MADS-box基因（DAL1/DAL14/DAL55）层级调控种子球果身份决定和侧生器官发育。此外，还发现了差异表达的CYP715亚家族细胞色素P450基因和类黄酮3,5-甲基转移酶基因，分别在芽身份转变和木质素生物合成中发挥作用。
**沿茎尖-基部轴的基因表达梯度反映侧生器官发育**
对侧生器官簇进行亚聚类分析，种子球果和acrocona过渡芽分别各鉴定出7个亚簇，具有distinct空间位置。Monocle3拟时分析显示，acrocona过渡芽10月样本中从顶端到底部呈现陡峭递增的拟时梯度，反映顶端细胞在形态转变过程中的发育重编程；种子球果中拟时值低区域位于先端分生组织和珠鳞，高拟时值位于苞片区域，表明该阶段珠鳞细胞比苞片更具分生组织特性。hdWGCNA共表达网络分析鉴定出8个共享模块，其中模块2和7主要定位于侧生器官，其模块特征基因（module eigengene）随拟时值增加呈下降趋势。模块2标记基因包括YABBY基因、MADS-box基因DAL2、DAL14及DAL55，确认其参与侧生器官发育；模块7则可能参与早期分生组织维持和细胞分裂。
**空间YABBY基因表达支持轴形成和侧生器官极性决定的保守机制**
系统发育分析显示，裸子植物YABBY基因分为YAB-A、YAB-B、YAB-C和YAB-D四个分支，P. abies中PaYAB-A（MA-112273g0010）和PaYAB-C（MA-10432332g0010）分别归属YAB-A和YAB-C分支，PaYAB-B（MA-407206g0010）归入YAB-B分支。空间表达分析表明，PaYAB-A和PaYAB-C在所有三个芽类型和所有时间点的侧生器官中均有表达；PaYAB-C在苞片中表达且向珠鳞方向呈递减梯度，PaYAB-A在苞片和珠鳞中均表达且呈斑驳模式。mRNA-ISH验证显示PaYAB-A在苞片远端部分表达最强。RT-qPCR证实PaYAB-B仅在春季营养芽原基中高表达，在9月和秋季种子球果中极低，故在ST数据集中未检测到显著水平。这些结果支持被子植物和裸子植物YABBY基因在决定侧生器官极性方面存在部分保守的祖先功能。
**讨论与结论**
本研究利用55微米分辨率的ST技术成功构建了挪威云杉生殖结构发育的时空基因表达图谱。该图谱将组织学信息与转录组信息相结合，使研究人员得以捕捉野生型和acrocona突变体从分生组织到分化侧生器官的转变过程，鉴定出DAL2和DAL14等种子球果身份标记基因在特定组织位置的表达模式。共表达分析鉴定出PaSPL1下游的DAL1、DAL14和DAL55等MADS-box基因，并基于空间表达模式、系统发育位置和DNA结合实验提出了从年龄依赖的DAL1经由PaSPL1/miR156/529到DAL14/DAL55的发育信号互作模型。拟时轨迹分析虽为单细胞测序设计，但成功可视化了侧生器官沿茎尖-基部轴的发育进程。该研究同时揭示了YABBY基因家族在裸子植物和被子植物间保守的轴形成和侧生器官极性决定机制。本研究的局限性包括55微米分辨率无法达到单细胞水平，以及所提出的互作模型尚需体内验证。总体而言，该时空图谱为针叶树生殖发育研究提供了宝贵资源，其方法策略也可推广至其他基因组复杂的非模式生物的发育研究。
