《International Journal of Molecular Sciences》：Extracellular Hemoglobin, Hypoxia, and Macrophage-Mediated Pulmonary Vascular Remodeling in Hemolytic Disease
摘要专业翻译
肺动脉高压（PH）是镰状细胞病和地中海贫血等慢性溶血性贫血公认的并发症，然而缺氧与无细胞血红蛋白（Hb）对疾病进展的相对贡献仍不完全清楚。溶血性贫血患者经历终生的慢性与间歇性缺氧循环，这一过程加剧了由细胞外Hb及其降解产物——血红素和铁——所驱动的血管损伤。尽管缺氧和Hb暴露的影响历来被分开研究，但持续低水平血浆Hb与慢性缺氧的联合效应——这一更接近稳态溶血的状态——在很大程度上被忽视。一项结合慢性缺氧与通过植入泵持续低剂量Hb输注的大鼠模型表明，即使适度的血浆Hb浓度（10–20 μM血红素）也对缺氧诱导的PH产生叠加效应。该效应与外膜巨噬细胞积聚增加、氧化应激和炎症相关，从而驱动更严重的肺血管重塑。基于该模型，研究人员评估了针对Hb介导血管损伤的治疗策略，重点关注重复剂量结合珠蛋白（Hp）疗法，因为Hp在镰状细胞病中常严重耗竭。恢复循环Hp可将血浆Hb隔离为无反应性的、区室化的Hb–Hp复合物，从而限制一氧化氮（NO）清除和氧化损伤。这些机制性发现进一步通过Berkeley镰状细胞病小鼠的骨骼肌微血管氧张力与运动能力研究，与功能性结局相关联。本综述综合了上述研究结果，以阐明缺氧、巨噬细胞生物学与细胞外Hb在驱动肺血管重塑中的相互作用，并突出新兴的针对Hb的溶血相关性PH治疗策略。
论文主体内容专业总结
1. 引言
溶血性贫血（如镰状细胞病和地中海贫血）继发的肺动脉高压（PH）发生率显著高于普通人群中原发性PH的发病率。当前PH的定义基于静息状态下肺动脉导管测量值>20 mmHg（原标准为>25 mmHg），反映了轻度压力升高即具有不良预后意义的证据。溶血性疾病相关的PH具有多种不同表型，本综述聚焦于毛细血管前性PH相关的血管病变。尽管关于急性高浓度Hb暴露及NO清除的机制研究已较充分，但慢性低水平血浆Hb暴露（更接近镰状细胞病和地中海贫血中稳态溶血状态）的病理生理后果仍不明确，尤其是与患者终生经历的缺氧联合作用时。既往研究多将缺氧或Hb暴露单独考察，未能充分表征这两种临床相关“打击”对肺血管重塑的叠加或协同效应。此外，尽管血管周围/外膜巨噬细胞积聚已被认为参与缺氧驱动的PH，但其与细胞外Hb暴露的特异性关系及其在溶血背景下“由外向内”肺血管重塑模型中的贡献尚未被系统综述。最后，尽管Hb清除作为治疗策略日益受到关注，但缺乏将基于结合珠蛋白（Hp）的疗法与溶血性疾病中运动能力等功能性全身结局相联系的整合证据。
本综述通过综合专门设计用于分离并联合持续低剂量Hb暴露与慢性缺氧的临床前研究，填补上述空白，从而直接评估其对肺血流动力学、血管重塑和外膜巨噬细胞表型的叠加效应。综述目标包括四点：（1）整合慢性缺氧与持续细胞外Hb暴露如何相互作用以驱动血管周围巨噬细胞积聚和肺血管重塑的机制证据；（2）评估在该模型中测试的基于Hp及其他靶向Hb的治疗策略作为溶血相关性PH潜在干预手段的效果；（3）将机制发现延伸至人源化镰状细胞病小鼠模型中微血管氧合和运动不耐受的转化性全身测量；（4）将这些发现与当前临床实践相联系。
溶血性贫血疾病状态引起的肺血管重塑具有多因素机制。慢性细胞外Hb诱导PH最被广泛研究和接受的机制是NO信号异常调节。NO耗竭与活性氧（如超氧阴离子O2•?）生成相关，后者源于循环或血管壁相关黄嘌呤氧化酶的增加。在这些促氧化条件下，NO迅速与超氧阴离子反应生成过氧亚硝酸盐（OONO?），这是一种有毒的活性氮物种。过氧亚硝酸盐是硝化/氧化损伤的关键介质，促进蛋白质硝化和氧化、脂膜破坏及血红素铁化学损伤。Hb可通过两种反应消耗NO：（I）氧合Hb（HbFe2+O2）的NO双加氧反应，生成硝酸盐阴离子（NO3?）和高铁Hb（HbFe3+）；（II）脱氧Hb（HbFe2+）的铁亚硝基化反应，即NO直接结合至还原态亚铁Hb的铁原子。两种反应均根据细胞外Hb暴露程度和持续时间导致急慢性血管活性改变。
Hb与过氧化物（H2O2）的反应可总结为：脱氧Hb（HbFe2+）与H2O2反应生成氧合亚铁Hb［Hb(Fe4+=O)］、高铁Hb［Hb(Fe3+)］及蛋白质自由基［•Hb(Fe4+=O)］。球蛋白链自由基可氧化Hb蛋白内的氨基酸和脂质，或转移至脂蛋白等分子，形成脂质-蛋白质加合物（4-羟基壬烯醛，4-HNE）。在Hb内部自由基反应中，位于α-珠蛋白/β-珠蛋白界面的特定肽段区域是氨基酸氧化的主要位点，其中β链Cys93和α链Tyr42是高铁Hb自由基形成后受影响的主要氨基酸，导致蛋白质去折叠、分子间交联及Hb分子逐渐降解为沉淀蛋白、血红素和铁。
2. 血红素、缺氧与巨噬细胞
在溶血性贫血相关PH中，慢性缺氧可能通过促进线粒体活性氧产生、损害氧化还原稳态、加剧NO耗竭和内皮功能障碍来放大溶血驱动的血管氧化应激。研究人员采用还原论方法，将可编程泵植入Sprague Dawley大鼠，在常氧和低氧（10% O2，海拔5500米，气压380 mmHg）条件下，以低剂量（12 mg/天；0.5 mg/h）和高剂量（35 mg/天；1.45 mg/h）持续输注无细胞Hb，持续3、5和7周。该模型中Hb输注浓度为3–10 μM血红素，与镰状细胞病（SCD）患者水平一致。常氧条件下观察到Hb诱导的肺动脉压显著升高，且该效应在低氧条件下进一步放大。这些发现支持慢性缺氧与持续低水平细胞外Hb暴露在驱动肺血管重塑中的叠加关系，并与肺血管外膜巨噬细胞积聚增加、氧化应激和炎症相关。
SCD人群中毛细血管前性PH的临床研究同样观察到缺氧和细胞外Hb机制共同驱动疾病进程。溶血性贫血的下游效应包括高凝状态、炎症和组织缺氧，这些可能与个体遗传易感性耦合，导致广泛基因表达改变。与血管重塑相关的显著通路（包括Wnt信号、钙信号、血管平滑肌收缩和癌症）在右心室收缩压升高的患者中均有体现，提示这些通路可能在PH发展中发挥贡献作用。
强有力证据表明，缺氧和富含Hb的微环境导致促氧化和炎症性巨噬细胞表型。Stenmark等人的研究结果提示，成纤维细胞和包括巨噬细胞在内的免疫调节细胞在缺氧期间促进肺血管滋养血管的扩张。这是由于血管外膜内驻留细胞的激活，导致活性氧的慢性产生和炎症，引起“由外向内”的肺血管重塑诱导/进展和PH。
3. 结合珠蛋白
组织驻留单核细胞/巨噬细胞的关键功能之一是清除Hb-结合珠蛋白（Hp）复合物。Hp是哺乳动物血浆和组织中主要的Hb结合蛋白，在溶血期间缓冲无细胞血红蛋白的增加。人类Hp存在三种主要表型（Hp 1-1、Hp 2-1和Hp 2-2），浓度范围为0.3–1.9 mg/mL。三种Hp多态性共享相同的Hb结合β珠蛋白链（Hpβ），但α珠蛋白链（Hpα1或Hpα2）不同，根据参与二硫键形成的α珠蛋白半胱氨酸残基数量形成二聚体（Hp 1-1）或多聚体（Hp 2-1、Hp 2-2）结构。在人体中，Hb-Hp复合物通过组织驻留单核细胞/巨噬细胞表面表达的清道夫受体CD163从循环中清除。CD163表达仅限于单核-巨噬细胞谱系细胞，在脾脏和肝脏的Kupffer细胞中高表达。Hb-Hp与CD163结合后，复合物通过内吞作用进入内体-溶酶体区室，血红素被血红素加氧酶-1（HO-1）降解为胆绿素并释放一氧化碳（CO），铁被释放并结合至细胞储存蛋白铁蛋白，CD163循环回细胞表面。
血红素还驱动巨噬细胞表型极化变化。Schaer等人证明，Hb与Hp复合物形成导致巨噬细胞极化为CD163—HO-1—HLA class 2low—抗氧化表型，这是一种替代性激活状态，支持受损组织部位的愈合。在Hb加缺氧大鼠模型中，每周两次Hp给药（90 mg/kg，静脉注射）减轻了Hb效应。实验观察证实，细胞外Hb可进入肺血管周围间隙，导致Hb氧化和血管组织内反应性非血红素铁积聚的级联反应，形成有利于氧化/炎症的组织微环境，表现为4-HNE免疫反应性增加、血管外膜炎症细胞（包括CD163+巨噬细胞群）积聚以及炎症分子ICAM-1和IL-6显著升高。此外，心肌细胞和右心心脏血管周围观察到铁积聚，提示Hb和缺氧诱导的病理生理进展导致心肺重塑指标增强。
4. Hb外渗、NO不敏感性与巨噬细胞依赖性重塑
Hb无论是在血管腔内还是外渗至血管周围间隙，均驱动血管功能障碍。多种临床前模型的研究表明，血管周围Hb积聚导致NO不敏感性、血管收缩、炎症以及内皮和平滑肌细胞功能障碍。此外，与其他类型PH类似，近期证据支持肺募集循环巨噬细胞在溶血性疾病PH中发挥关键作用。然而，现有数据无法明确解决管腔内游离Hb对NO的血管内清除与随后外膜铁/巨噬细胞积聚之间的时间顺序，因为这些过程可能在重叠的时间尺度上发生。管腔内NO消耗本身可能通过内皮功能障碍及向下游外膜的信号传导，在可检测的Hb外渗之前或独立于此，促成早期成纤维细胞激活。
来自已故SCD-PH患者肺组织的证据表明，严重血管重塑（内膜增厚、丛状病变、中膜肥厚）与铁沉积及表达HO-1、ET-1和IL-6的CD163+细胞共定位，提示慢性缺氧和Hb暴露塑造了独特的巨噬细胞表型。巨噬细胞中铁积聚可能主要由血管外溶血和红细胞吞噬驱动。巨噬细胞募集至肺外膜也是当前研究领域。与其他类型PH（包括缺氧和血吸虫病）类似，外膜成纤维细胞可能通过上调IL-6及其补体在该过程中发挥关键作用。巨噬细胞耗竭（GdCl3）可降低Hb加缺氧暴露大鼠的肺动脉压、减轻右心室肥厚并减弱血管重塑，但GdCl3对循环巨噬细胞以及肝脾巨噬细胞均有毒性，使得评估特定巨噬细胞池作为疾病进展根源来源变得困难。
巨噬细胞表型随时间演变。在Hb加缺氧暴露早期（第18天），血管周围巨噬细胞表达ET-1；至第35天，载铁巨噬细胞额外表达HO-1和IL-6。这种清除相关HO-1与血管活性和炎症介质的组合，提示一种不同于纯粹保护性清道夫角色的疾病特异性表型。巨噬细胞耗竭减少铁积聚和重塑，进一步支持巨噬细胞作为溶血、铁沉积、缺氧与疾病进展之间机制联系的证据。
关于巨噬细胞在疾病消退期间是否保持均匀的损伤性功能或发生功能转变，研究显示在Hb加缺氧暴露后于常氧无Hb条件下恢复的未治疗动物中，PH出现部分消退：肺动脉压下降、右心室功能改善、重塑减轻。恢复期巨噬细胞耗竭损害消退过程，导致比未耗竭动物更高的压力和更显著的重塑。耗竭肺中CD163向CD68表达的转变提示巨噬细胞亚群改变而非完全消除，可能涉及不同巨噬细胞表型在损伤和修复中的不同作用。然而，鉴于未螯合镧系元素的广泛脱靶全身效应，在将功能变化完全归因于巨噬细胞消除之前，必须考虑GdCl3同时阻断L型钙通道和改变组织铁处理等非免疫机制。
恢复期间的分子变化强化了这一双重作用。IL-6在巨噬细胞耗竭与否的情况下均下降，表明仅去除Hb和缺氧即足以减少该炎症信号。相反，ET-1在恢复期间持续升高，除非巨噬细胞被耗竭，表明巨噬细胞是血管活性信号的持续来源。巨噬细胞耗竭肺中HO-1表达升高，尤其在血管细胞中，提示代偿性应激反应未能完全解决潜在损伤。综合而言，这些发现支持巨噬细胞在活动性溶血驱动的PH中作为有害效应细胞，同时也参与血管恢复——其表型和时机决定净效应是促进重塑还是消退。
5. Hb、血红素和铁处理的治疗靶向
慢性溶血在主要Hb和血红素清除剂Hp和血红素结合蛋白（Hpx）耗竭后，促进血浆脂蛋白的氧化损伤。SCD患者血浆中，游离Hb、总血红素和非转铁蛋白结合铁升高伴随Hp耗竭和Hpx降低，提示随着清除能力丧失，血红素铁越来越多地转移至脂蛋白——将铁定位为血管损伤的主动驱动因素而非单纯副产物。Berk-SS小鼠重现了这一模式，在血红素-白蛋白暴露后表现出比野生型小鼠更显著的脂质氧化。SCD-PH患者的尸检肺组织进一步将该氧化过程与巨噬细胞丰富的血管病理联系起来，增厚的内膜/外膜中沉积氧化型低密度脂蛋白，血管周围巨噬细胞强摄取——提示巨噬细胞作为溶血驱动氧化损伤和重塑的放大器。
6. 外周氧转运与临界速度作为功能性终点
除血管效应外，Hb介导的NO清除还损害外周氧转运：急性无细胞Hb暴露将收缩骨骼肌微血管PO2降低至与NOS抑制相似的程度，当Hb与Hp复合时该效应基本被阻止。这一外周机制与肺血管功能障碍相结合，导致SCD中的运动不耐受。Berk-SS小鼠在中度海拔饲养三个月后表现出溶血加重、右心室收缩压升高、eNOS/内皮素平衡破坏以及运动能力较海平面对照组降低，证明即使适度缺氧也会恶化SCD的心肺和功能结局。
临界速度（CS）——有氧代谢可支持的最大持续运动速度——已成为临床前功能性终点，类似于人类六分钟步行试验，整合了中枢心肺功能与外周O2>输送-利用匹配。膳食硝酸盐补充使Berk-SS小鼠的CS恢复正常，结合微血管PO2发现，确立了使用CS评估血红素清除疗法的机制依据。
该框架被应用于测试缺氧应激Berk-SS小鼠中的血红素结合蛋白补充治疗。暴露于三个月低压缺氧并用低剂量或高剂量皮下Hpx治疗的Berk-SS小鼠表现出剂量依赖性CS改善，高剂量Hpx显著超过载体对照组。该获益发生在未纠正贫血的情况下（血细胞比容和脾重不变），表明Hpx通过减轻血红素毒性而非恢复红细胞量发挥作用。Hpx还改善了右心室力学——降低僵硬度、增加每搏输出量和心输出量、降低后负荷、改善心室-血管耦合——尽管右心室收缩压和肥厚仅部分逆转。组织学和多组学分析证实了这些功能获益：Hpx治疗减少了肺中载铁巨噬细胞、脂质过氧化、纤维化和血管重塑，并减轻了右心室的氧化损伤和间质纤维化。影像学证实Hb和血红素均发生间质外渗，支持Hpx通过中和组织血红素毒性改善心肺功能和运动表现的模型。
7. 血红素/Hb清除：局部递送与联合治疗
在系统性Hpx替代治疗的基础上，后续研究探索了更具靶向性的血红素清除策略。由于铁和血红素优先积聚在肺外膜和血管周围区域，研究人员测试了雾化Hpx递送，以在肺中集中血红素中和同时限制全身暴露。每周两次肺内Hpx给药持续10周，定位于肺泡和血管周围区域而无显著全身摄取，减少了肺铁沉积和氧化标志物（4-HNE、HO-1），并在不纠正贫血的情况下改善了运动能力（临界速度增加约16%）。右心室僵硬度、后负荷、每搏输出量、心输出量和心室-血管耦合均改善，同时肺血管阻力降低，中膜增厚呈减少趋势。蛋白质组学分析支持这些功能获益，显示肺中抗氧化（硫氧还蛋白、谷胱甘肽）和铁处理通路恢复，右心室重塑/炎症信号减少。
另一相关策略联合Hp和Hpx以同时清除Hb和游离血红素（两者在SCD中均耗竭）。在暴露于慢性缺氧以加速PH发展的Berk-SS小鼠中，每周两次Hp + Hpx治疗产生相似的生理和分子特征：改善右心室力学（降低僵硬度，提高心输出量，改善心室-血管耦合），降低肺血管阻力和中膜肥厚，蛋白质组学/代谢组学变化与肺和右心室氧化应激、炎症和纤维化信号减少一致。值得注意的是，两种方法均汇聚于一个共同的细胞发现：存在于人类SCD-PH肺组织并在Berk-SS小鼠中重现的载铁血管周围巨噬细胞在治疗后减少。这表明限制细胞外Hb/血红素负荷——无论是通过肺靶向还是联合全身清除——均能减少巨噬细胞铁负荷及其对氧化损伤和血管重塑的下游贡献。
8. 通过铁转运蛋白抑制实现铁限制
另一种策略不是细胞外拦截Hb或血红素，而是靶向巨噬细胞和红细胞在Hb/血红素摄取后的铁处理。铁转运蛋白抑制剂限制细胞铁输出，已在多种疾病模型中显示疗效；在SCD中，减少铁可用性可降低平均红细胞血红蛋白和镰变倾向，可能减轻下游血管损伤。
在暴露于亚慢性缺氧的Berk-SS小鼠中，铁转运蛋白抑制剂VIT-2763（vamifeport）诱导铁限制性红系表型——平均红细胞血红蛋白和体积降低、低色素/小细胞性红细胞、镰状细胞减少——而不恶化总血红蛋白。伴随溶血减少的标志物：脾红细胞淤积减少、血浆和肾铁降低、血浆Hpx增加、脾载铁巨噬细胞减少。心肺获益与这些血液学变化平行，包括右心室肥厚减轻、Fulton指数降低、肺动脉中膜增厚减少、肺血管阻力降低和右心室力学改善，使治疗小鼠向接近健康对照的表型转变。肺和右心室的蛋白质组学分析显示与铁硫簇稳态改善、氧化应激减少以及炎症和重塑信号减弱一致的变化。虽然该研究表明铁限制在减轻小鼠模型PH进展方面具有总体获益，但对铁过载巨噬细胞的影响仍存在关键知识空白——这些巨噬细胞是变成惰性含铁囊泡还是变得具有反应性并影响免疫系统功能仍不清楚。
与基于清除剂的方法类似，载铁肺血管巨噬细胞在人类SCD-PH组织和Berk-SS小鼠中均作为关键病理特征出现，VIT-2763治疗后其减少——伴随脾载铁巨噬细胞减少——提示红细胞吞噬铁负荷降低。综合而言，清除和铁限制策略的发现强化了巨噬细胞作为SCD-PH中铁处理、氧化应激和血管重塑的主动参与者而非被动溶血标志物的观点。
当前临床实践： 镰状细胞病相关PH影响约10%的患者，呈现多种内型，包括毛细血管前性肺动脉高压（PAH，5%）、慢性血栓栓塞性PH（CTEPH，2%）和毛细血管后性PH（3%），均具有显著死亡风险。临床指南推荐羟基脲作为一线治疗，并建议避免使用PDE5抑制剂（如西地那非）。这与β地中海贫血PH患者指南形成对比，后者建议使用PDE5抑制剂以及其他PH治疗药物（包括内皮素受体拮抗剂、前列环素激动剂）。此外，慢性输血被条件性推荐用于镰状细胞病和β地中海贫血患者。
治疗开发的机制见解： 从上述研究来看，新型治疗开发应遵循若干原则。首先，生物标志物应指导治疗选择，包括常见溶血标志物（血浆血红蛋白、结合珠蛋白、血红素结合蛋白、LDH和精氨酸酶）以及与炎症（IL-6、CRP）和巨噬细胞铁负荷相关的机制标志物，可能提供个体化治疗选择。NO清除和Hp/Hpx蛋白的临床前成功证据表明这应作为优先方向。可溶性鸟苷酸环化酶已被证明优于PDE-5抑制。精氨酸酶抑制也显示疗效，表明底物可用性（L-精氨酸）和酶抑制均值得临床研究。结合珠蛋白和血红素结合蛋白蛋白疗法以及胎儿血红蛋白诱导剂和铁转运蛋白抑制剂也突出了靶向根本原因的策略。溶血性疾病相关PH治疗的关键空白是这些发展中疗法缺乏任何人体试验。
9. 未来方向
未来研究应定义慢性缺氧、细胞外Hb、血红素、脂质氧化和铁潴留在肺血管外膜中汇聚时出现的巨噬细胞表型。在Hb + 缺氧、雾化Hpx、联合Hp + Hpx或铁限制治疗后，对肺和血管周围巨噬细胞群体进行转录组学分析，可确定这些细胞是否采用Hb/血红素清除、铁潴留、脂质处理、血管活性信号和炎症重塑的混合程序。这些研究还可测试缺氧诱导的代谢重编程（包括Stenmark团队描述的CtBP1介导的HO-1抑制）是否促成高铁、低HO-1的巨噬细胞状态，该状态有利于重塑而非消退。
载脂蛋白/脂蛋白聚焦研究将进一步测试Hb和血红素驱动的脂质氧化是否创造将溶血与外膜炎症和血管重塑联系起来的巨噬细胞表型。这与巨噬细胞内铁潴留增加可作为促炎信号相关。RNA测序和载脂蛋白/脂蛋白研究相结合，可帮助区分保护性清道夫巨噬细胞与主动驱动SCD-PH进展的铁和脂质负载巨噬细胞群体。
10. 结论
综合而言，本综述所回顾的研究支持以下模型：缺氧放大溶血性疾病中细胞外Hb的血管毒性。一旦Hb逃逸血管腔进入血管周围间隙，即消耗NO、发生氧化、释放血红素和铁，并促进脂质过氧化、炎症和血管重塑。这些事件与血管周围巨噬细胞积聚密切相关，尤其是肺外膜中的载铁巨噬细胞。临床前研究中，骨骼肌微血管PO2和临界速度研究表明，除肺血管外，细胞外Hb/NO生物学还损害外周O2输送-利用匹配和全身运动表现。这些观察确定了若干针对溶血上游组分的有前景治疗策略，包括结合珠蛋白和血红素结合蛋白。此外，通过铁转运蛋白抑制减少铁释放提供了一种补充方法，通过限制铁可用性、减少红细胞镰变和溶血以及限制高铁巨噬细胞积聚。最后，本综述强调缺氧、细胞外Hb、血红素/铁转运、骨骼肌O2转运和巨噬细胞生物学是溶血相关PH和运动不耐受紧密联系的驱动因素。
