《International Journal of Molecular Sciences》：Transcriptomic Profiling of Laser Capture Microdissected FFPE Esophageal Tissues Identifies Candidate Genes and Pathways Associated with Esophageal Adenocarcinoma
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食管腺癌（esophageal adenocarcinoma, AC）的发病率近几十年来在美国和其他西方国家显著增加。胃食管反流病（gastro-esophageal reflux disease, GERD）可导致Barrett食管（Barrett’s es
食管腺癌（esophageal adenocarcinoma, AC）的发病率近几十年来在美国和其他西方国家显著增加。胃食管反流病（gastro-esophageal reflux disease, GERD）可导致Barrett食管（Barrett’s esophagus, BE），后者与AC的发生密切相关。然而，AC发病的机制仍不明确。在这项探索性初步研究中，研究人员利用激光捕获显微切割（laser capture microdissection, LCM）从经组织学确认的福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE）食管活检组织中提取RNA，通过RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）对6例正常食管（WT）、4例伴低级别异型增生的Barrett食管（BL）和6例食管腺癌（AC）样本进行了转录组分析。差异基因表达分析显示，样本按组织学分组出现部分分离，BL与AC之间存在重叠。与WT样本相比，BL和AC组均显示大量差异表达基因；但BL与AC组之间差异表达基因较少。研究人员共鉴定出3062个差异表达基因（WT vs. AC 2289个；WT vs. BL 1854个；BL vs. AC 130个）。通过KEGG通路分析和功能注释，鉴定出候选基因和通路。与细胞外基质、黏着斑和PI3K-AKT通路相关的基因在BL和AC中相对于WT上调，而与角化、Ras/Rap1和Hippo信号相关的基因在BL和AC中相对于WT下调。少量基因（如ANPEP、REG4、MEP1A）可将BL与AC区分开来，是有待进一步研究的差异表达候选基因。这项探索性转录组分析为AC发病相关的基因表达变化提供了见解，并确定了需要通过qRT-PCR、免疫组织化学和功能研究进行独立验证的候选基因和通路。
**一、研究背景与现存问题**
食管癌（esophageal cancer, EC）是全球最致命且侵袭性最强的恶性肿瘤之一。食管腺癌（esophageal adenocarcinoma, AC）是EC的主要组织学亚型，自20世纪70年代以来发病率在美国等西方国家增加了约600%，目前已约占西方人群EC的60%。胃食管反流病（gastro-esophageal reflux disease, GERD）是AC最重要的危险因素之一，可导致Barrett食管（Barrett’s esophagus, BE）。BE是AC唯一公认的癌前病变，患者发生AC的风险增加30至60倍，通常经过非异型增生、低级别异型增生、高级别异型增生进而发展为AC。目前对BE患者的管理主要依赖内镜监测活检，并以组织学异型增生分级作为评估AC风险的主要依据。然而这一策略存在明显不足：多数BE患者终生不会进展为AC，过度监测造成医疗负担；BE常无症状，许多患者未被诊断；异型增生分级存在观察者间差异，且难以与再生性改变或活动性炎症区分。因此，亟需更有效的分子标志物以将内镜监测集中于高风险患者。然而AC发病的分子机制仍未阐明，本研究旨在通过比较正常食管、伴低级别异型增生的BE和AC组织的转录组，鉴定与AC发病相关的候选基因和通路，为早期诊断和干预提供依据。
**二、研究内容与总体结论**
研究人员利用激光捕获显微切割（LCM）从经组织学确认的FFPE食管活检组织中分离纯化细胞，提取RNA后进行RNA测序（RNA-seq），对6例正常食管（WT）、4例伴低级别异型增生的Barrett食管（BL）和6例AC样本进行转录组分析。通过差异表达分析、KEGG通路分析和功能注释，共鉴定出3062个差异表达基因：WT vs. AC有2289个，WT vs. BL有1854个，BL vs. AC仅有130个。多维尺度分析显示WT、BL、AC形成三个主要聚类，BL与AC部分重叠且更接近，与二者共同的柱状细胞表型一致。与WT相比，BL和AC中与细胞外基质（extracellular matrix, ECM）、黏着斑和PI3K-AKT信号相关的基因上调，而与角化、Ras/Rap1和Hippo信号相关的基因下调。BL与AC之间差异基因较少，其中ANPEP、REG4、MEP1A等基因可区分两种组织状态，是值得进一步验证的候选标志物。该研究为理解AC发病过程中的基因表达重编程提供了数据资源，所鉴定的候选基因和通路需通过qRT-PCR、免疫组织化学及功能研究进行独立验证，未来有望用于AC的风险分层和早期诊断。
**三、主要关键技术与方法**
样本来自美国印第安纳州Goshen Center for Cancer Care，经Goshen Health机构审查委员会批准，共16例（6例WT、4例BL、6例AC），每例来自不同患者。主要方法包括：对FFPE组织切片进行激光捕获显微切割（LCM）以获取纯化细胞；提取RNA后进行RNA-seq；测序数据比对至人类参考基因组hg38，使用edgeR进行差异表达分析（差异倍数>2，FDR < 0.1）；利用DAVID数据库进行KEGG通路分析和基因本体（GO）功能注释，其中WT与BL、WT与AC比较采用FDR < 0.001，BL与AC比较采用FDR < 0.1。
**四、研究结果**
**2.1 所选FFPE样本提取RNA的质量**
通过苏木精-伊红（H&E）染色确认了正常食管、BE伴低级别异型增生及AC的组织学转变。LCM成功地从Arcturus Histogene染色的FFPE切片中分离出目标细胞。Agilent Bioanalyzer RNA质量评估显示，FFPE来源RNA呈降解状态，18S核糖体峰变宽并出现片段化产物，但RNA仍适用于所选建库流程。
**2.2 组织类型分析**
利用edgeR的plotMDS功能对转录组进行无监督多维尺度分析，结果显示WT、BL和AC样本形成三个主要聚类，且BL与AC聚类更接近。这与BL和AC为柱状表型、WT为鳞状表型一致，也说明鳞状与柱状组织之间的分离主要由柱状表型相关基因驱动。
**2.3 差异表达分析**
共鉴定出3062个差异表达基因。维恩图显示WT vs. BL与WT vs. AC之间存在大量重叠，其中1084个基因在BL和AC中均相对于WT差异表达，主要与柱状表型相关。BL vs. AC比较中差异基因较少，且多数与柱状表型无关，可能具有组织学阶段特异性。热图展示的各比较组前50个差异表达基因大多呈现一致的上调或下调方向。
**2.4 KEGG通路分析与功能注释**
KEGG通路分析显示，BL和AC中上调基因主要富集于细胞增殖、细胞外基质、黏着斑、PI3K-Akt信号及细胞膜转运体相关通路；下调基因则主要富集于Ras、Rap1、Hippo信号及代谢通路。功能注释显示，BL和AC中上调功能簇主要为细胞外信号和细胞外基质结构及黏着斑，而下调功能簇主要为细胞间黏附、紧密连接形成和表皮角化。BL vs. AC比较中，代谢通路相关基因在BL中相对AC上调，而少量基因如ANPEP、REG4、MEP1A可区分BL与AC，值得进一步研究。
**五、讨论总结**
讨论部分指出，WT与BL或AC之间差异表达基因数量远多于BL与AC之间，提示在化生–癌变序列早期已发生大规模转录重编程。BL和AC共有的上调基因多与细胞外基质、黏着斑及PI3K-Akt信号相关，共有的下调基因多与Ras/Rap1、Hippo信号、角化及细胞间黏附相关。部分候选基因如CDX1/CDX2、FABP1、AGR3、EPCAM、HOXA13、VIL1、FAM83H等与肿瘤发生或上皮–间质转化有关。AC中还存在与细胞分裂、细胞周期检查点相关的增殖信号特征。MPP7在BL中较WT上调，但在AC中较WT下调，其与黏附复合体、紧密连接形成及自噬调控有关，可能成为阶段特异性标志物。代谢相关基因在BL和AC中变化提示肿瘤代谢重编程。研究还讨论了角化相关基因簇中激肽释放酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂的染色体邻近性，提示可能存在染色体区域缺失，但需进一步验证。主要局限性包括样本量小、BL仅4例、缺少高级别异型增生组、横断面设计无法评估纵向进展、缺乏独立验证、FFPE RNA降解、患者性别等临床信息因伦理限制无法纳入协变量分析等。
**六、结论翻译**
总之，对16例食管组织的基因表达分析显示，组织类型间共有3062个差异表达基因。与表型相似性一致，BL与AC聚类存在一定重叠，但与WT聚类明显区分。KEGG通路和功能注释分析确定了与AC进展阶段相关的若干通路和生物学过程：与WT相比，细胞外基质及其信号、黏着斑和细胞代谢相关通路在BL和AC组织中通常上调，而角化以及Ras、Rap1和Hippo信号通路通常下调。尽管BL和AC样本之间存在显著相似性，但代谢通路在BL样本中差异上调。本研究结果提供了有价值的数据来源，以鉴定需要独立验证的候选基因和通路。需要在更大规模的独立队列中进行进一步研究和功能验证，以确定其在AC中的生物学及潜在临床意义。
