《Biomolecules》：Early-Life Stress Programs a Vulnerable Renal Phenotype Under Metabolic Challenge in a Murine Model
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摘要
早期生命应激与断乳后高脂饮食（high-fat diet，HFD）暴露已被独立证实与肾脏异常相关；然而，关于这两种应激源如何相互作用以增加肾脏对后续代谢挑战的易感性，目前知之甚少。为此，本研究评估了母体分离（maternal separation，MS）
摘要
早期生命应激与断乳后高脂饮食（high-fat diet，HFD）暴露已被独立证实与肾脏异常相关；然而，关于这两种应激源如何相互作用以增加肾脏对后续代谢挑战的易感性，目前知之甚少。为此，本研究评估了母体分离（maternal separation，MS）诱导的早期生命应激及断乳后HFD对雄性C57BL/6小鼠肾脏结构与功能的影响。动物被分为MS组或未处理组（unmanipulated，UM），随后分别饲喂对照饮食（control diet，CD）或HFD直至出生后第133天，由此形成四个实验组：UM-CD、UM-HFD、MS-CD和MS-HFD。肾脏结构通过肾质量、肾小体组织学分析、肾小球数密度（numerical density，Nv）及个体肾小球体积（individual glomerular volume，IGV）的体视学定量进行评估，而肾功能则以尿量（diuresis）为指标进行评价。MS和HFD均独立增加肾质量、改变尿量、降低肾小球Nv并促进肾小球肥大。组织学分析显示系膜扩张、肾小囊腔狭窄、局灶性毛细血管闭塞及肾小球-囊壁粘连，这些改变在MS-HFD组中尤为显著。双因素方差分析显示两种因素对Nv存在独立效应，而对IGV则存在显著交互作用。Nv降低与IGV及尿量增加相关。上述发现表明，早期生命应激与断乳后HFD通过互补机制促进肾小球重塑，从而增加代谢性肾损伤的易感性。
早期生命应激与高脂饮食交互编程肾小球损伤：一项基于母体分离模型的整合性形态功能学研究解读
一、研究背景与科学问题
慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）是全球重大公共卫生问题，影响超过10%的人口，并与心血管疾病发病率和死亡率显著相关。传统观点认为CKD主要源于成年期获得性危险因素，如高血压、糖尿病和肥胖；然而，越来越多的证据表明，肾脏损伤的易感性可能起源于生命早期的发育编程机制。健康与疾病发育起源假说指出，发育关键期的不良暴露可永久性改变器官结构与功能，增加生命后期慢性疾病的发生风险。
肾脏对这一现象尤为敏感，因为肾单位生成（nephrogenesis）发生在有限的时间窗口内，决定了终身维持的最终肾单位储备。在人类中，肾生成约在妊娠36周结束，而小鼠的肾生成则延续至出生后早期。事实上，小鼠约51%的肾单位在出生至出生后第4天之间形成，此期间肾脏发育高度活跃且易受环境不良因素影响。因此，该关键窗口期的损伤可减少肾单位储备并永久损害肾功能储备能力。
肾单位储备减少已被证实与高血压、肾小球肥大、蛋白尿及成年期CKD风险增高相关。根据Brenner超滤假说，肾单位丢失触发剩余肾单位的代偿性血流动力学反应，包括单个肾单位滤过率增加和肾小球肥大。尽管这些反应最初可维持整体肾功能，但持续的超滤状态会逐步促进肾小球损伤并加速CKD进展。
早期应激是持续性代谢、神经内分泌和免疫改变的重要编程因素。母体分离（maternal separation，MS）是研究新生期应激最广泛使用的实验模型之一，通过反复中断母婴互动来模拟早期不良经历。在啮齿类动物中，MS在发育关键期激活下丘脑-垂体-肾上腺轴，增加糖皮质激素暴露并改变神经内分泌调节。此外，MS已被证实可诱导成年肾脏的持续性炎症编程，表现为肾脏炎症标志物升高和对加剧免疫反应的更高易感性。
与此同时，肥胖和高脂饮食（high-fat diet，HFD）已成为CKD发展的重要贡献因素。肥胖相关性肾小球病以肾小球增大、足细胞损伤和进行性肾小球硬化为特征。增加的代谢需求要求肾脏进行代偿性适应，包括肾小球滤过增加和肾小球肥大。实验研究表明，断乳后暴露于HFD可诱导肾脏脂质蓄积、炎症、肾小球改变和肾功能受损。
然而，尽管早期不良经历、肥胖与CKD风险之间的关系日益受到重视，但鲜有实验研究评估新生期应激与断乳后HFD暴露对肾小球形态功能重塑的联合效应。尤其是，将组织学、定量和功能分析整合起来，共同研究发育编程相关的早期肾小球改变，在结合新生期应激和断乳后HFD暴露的模型中更为罕见。因此，本研究旨在确定MS和断乳后HFD暴露对雄性C57BL/6小鼠肾脏结构和功能的影响。
二、研究设计与主要技术方法
本研究使用来自UFRO-DIUFRO项目框架内建立的实验模型的肾组织样本。该原始模型旨在评估断乳后MS和HFD对雄性C57BL/6小鼠内分泌胰腺结构和功能的影响，利用相同动物将分析扩展至其他代谢相关组织，遵循3R原则中的减少和优化原则。实验程序符合实验动物护理和使用指南及现行动物福利法规。智利拉弗龙特拉大学科学伦理委员会于2024年5月28日批准原始方案，并于2025年1月22日批准本研究的特定样本分析。
实验使用20只雌性C57BL/6小鼠，经交配确认后单笼饲养。幼崽出生日记为PND0，每窝调整至7只以确保哺乳期营养均一。在PND2，即MS开始的第一天，采用Wolterink-Donselaar等方法通过肛门生殖器区域深色斑点进行性别鉴定，仅纳入雄性幼崽。MS组在PND2至PND5期间每日分离4小时，PND6至PND16期间每日分离8小时，并于PND17提前断乳；UM组幼崽自出生至PND21标准断乳期间始终与母鼠同笼。断乳时，每窝随机选取一只雄性幼崽按分配饮食饲喂：对照饮食（CD，70g脂肪/1000g饲料，3.95kcal/g）或HFD（200g脂肪/1000g饲料，4.95kcal/g），两种饮食均由PRAGSOLU??ES Biociências专门制备，含符合美国营养学会推荐的完整维生素和矿物质混合物。由此形成四个实验组：UM-CD、UM-HFD、MS-CD和MS-HFD，每组5只动物，共20只雄性小鼠，饲喂至PND133。仅纳入雄性小鼠，因雌性发情周期可能引入影响食物摄入等参数的额外变异。样本量依据形态学实验研究广泛采用的方法学和统计学标准确定，并与3R原则一致。实验设计未实施盲法，因MS方案和饮食干预需要按实验组进行差异化动物处理。
PND133后，小鼠被单独置于代谢笼中24小时收集尿液以量化尿量，随后通过氯胺酮/赛拉嗪过量麻醉处死。左肾在体视显微镜下仔细解剖，用分析天平测定质量，随后于4%缓冲福尔马林中固定48小时，经脱水、常规组织学处理并整体包埋于Paraplast Plus中。右肾立即冷冻保存用于后续研究。组织学评估使用5μm厚连续切片苏木精-伊红染色，观察肾小囊、肾小囊腔、肾小球毛细血管网、足细胞、系膜及细胞形态。肾小球数密度（numerical density，Nv）采用物理体视框原理估计，进行随机均匀系统采样，在每侧肾脏的肾皮质内分析89个计数框，每个计数框面积为687,830μm2，目标抽样误差系数约为5%。个体肾小球体积（individual glomerular volume，IGV）采用Cavalieri原理估计，每只小鼠随机选取5个肾小球，获取20张5μm连续切片，使用ImageJ软件测定各肾小球剖面面积。所有数据先经正态性和方差齐性检验，以均数±标准误表示，采用双因素方差分析和Tukey多重比较检验组间差异，显著性水平设为p<0.05。每窝仅纳入一只雄性后代以避免伪重复，以窝作为实验单位。统计分析使用编码数据集进行，仅在统计完成后揭示组别身份。
三、研究结果
3.1 肾质量
UM-CD组肾质量最低，为研究基线。其余各组肾质量均增加，其中UM-HFD组增幅最大（较UM-CD增加51%），其次为MS-CD组（较UM-CD增加35.2%）。多重比较显示仅UM-CD组与MS-CD组（p=0.02）及UM-HFD组（p=0.001）差异显著。双因素方差分析显示饮食对肾质量有显著主效应（占总方差33.1%），且操作类型与饮食之间存在显著交互作用（占总方差20.2%，p=0.01），表明MS对肾质量的影响取决于饮食条件——MS在CD条件下增加肾质量，而在HFD条件下轻微降低肾质量。
3.2 尿量
UM-CD组尿量最低。MS-CD组较UM-CD增加71.2%，UM-HFD组增加37.7%，MS-HFD组最高（较UM-HFD增加51.0%，较MS-CD增加21.4%）。双因素方差分析显示操作类型（占总方差49.0%）和饮食（占总方差13.5%）均有显著效应。MS-CD组与UM-CD组（p=0.02）及MS-HFD组与UM-HFD组（p=0.02）差异显著，而UM-CD与UM-HFD之间无显著差异，表明HFD单独不足以引起可检测的尿量变化。未发现显著交互作用，提示MS-HFD组的尿量增加为两因素的累积效应而非协同作用。
3.3 肾小体组织学分析
UM-CD组肾小体形态保存完好，肾小囊外层为单层立方上皮，肾小囊腔清晰，肾小球毛细血管网排列有序，系膜分布于毛细血管袢之间。UM-HFD组肾小球整体结构基本保留，但可见细胞增多、囊外层高度增加、肾小囊腔减小及形态学上符合脂质蓄积的空泡结构。MS-CD组部分肾小体显示囊外层高度增加，肾小球内可见明显核改变，包括散在的固缩核和核溶解核，细胞核扁平化，系膜基质显著扩张，符合早期肾小球硬化改变；部分肾小球出现节段性毛细血管闭塞、肾小囊腔进一步缩小及局灶性肾小球-囊壁粘连。MS-HFD组肾小球核改变更为显著，大量固缩核和核溶解核分布全肾小球，可见符合脂质蓄积的空泡结构，细胞体积增大，特别是形态学上基于其在肾小囊脏层特征性位置被识别为足细胞的细胞；同时伴有广泛系膜扩张，符合局灶节段性肾小球硬化改变，并可见局灶性毛细血管闭塞和肾小球-囊壁粘连，反映肾小球结构受损程度较其他组更为严重。
3.4 体视学发现
UM-CD组肾小球Nv最高。MS-CD组较UM-CD降低17.3%，UM-HFD组降低11.4%，MS-HFD组降低最为显著（较MS-CD降低15.2%，较UM-HFD降低20.8%）。双因素方差分析显示操作类型（占总方差59.80%）和饮食（占总方差26.85%）对Nv均有显著效应，但无显著交互作用，表明两因素独立贡献。多重比较显示UM-CD与MS-CD（p=0.0001）、UM-CD与UM-HFD（p=0.007）、MS-HFD与MS-CD（p=0.003）及MS-HFD与UM-HFD（p<0.0001）之间差异显著。Spearman相关分析显示Nv与尿量呈强负相关（r=-0.83，p<0.0001）。
IGV方面，UM-CD组最低。MS-CD组较UM-CD增加35.5%，UM-HFD组增加13.3%，MS-HFD组增加最为显著（较MS-CD增加42.0%，较UM-HFD增加69.8%）。双因素方差分析显示操作类型（占总方差53.23%）和饮食（占总方差20.35%）均有显著效应，且存在显著交互作用（占7.89%）。Tukey事后检验确认UM-CD与MS-CD（p=0.040）、MS-CD与MS-HFD（p=0.0009）及UM-HFD与MS-HFD（p<0.0001）之间差异显著，而UM-CD与UM-HFD之间无显著差异（p=0.68）。Pearson相关分析显示Nv与IGV呈极强负相关（r=-0.85，p<0.0001），IGV与尿量呈中等显著正相关（r=0.68，p<0.001）。
四、讨论与结论
讨论部分指出，MS和HFD均诱导肾小球形态功能改变，但两因素对各参数的作用方式不同。尿量和Nv表现为无显著交互作用的累积效应，而肾质量和IGV则显示显著交互作用，提示早期应激和代谢超负荷的共存部分增强了某些肾重塑过程。HFD诱导肾质量显著增加，而MS对尿量影响为主。肾质量增加与HFD引起的代谢负担相关，包括体重增加和总胆固醇升高。MS对尿量的主要影响可能与其诱导的持续性交感激活、神经源性高血压和肾血流动力学改变有关，通过压力-利尿机制促进水钠排泄。
Nv降低的机制方面，MS暴露发生于小鼠肾生成关键窗口期，可能通过下丘脑-垂体-肾上腺轴过度激活和糖皮质激素暴露干扰正常肾发育过程，也可能与GDNF/RET等肾发育调控通路改变有关；HFD则通过肾脂质浸润、炎症、系膜扩张和早期肾小球损伤等机制促进进行性肾小球损伤。IGV增加是肾单位减少后的主要代偿性适应反应，MS是IGV增加的主要决定因素，而HFD与MS联合产生最严重改变，支持"双重打击"概念——早期不良暴露增加对后期代谢危险因素的易感性。
研究局限性包括未估计肾皮质总体积、缺乏分子和血流动力学分析、未评估直接肾超滤标志物、肾功能评估主要基于尿量以及MS与UM组断乳年龄不同。尽管如此，组织学、定量和功能分析的整合为MS和HFD诱导的肾表型提供了一致性表征。
研究结论为：MS和断乳后HFD暴露在雄性C57BL/6小鼠中诱导肾脏结构和功能改变。MS与尿量和肾小球Nv改变相关，而HFD主要影响肾质量。MS和HFD对IGV存在显著交互作用，表明联合暴露通过两因素间的交互影响肾小球大小。此外，MS和HFD的共存产生最显著的肾小球组织学改变，伴随更低的Nv和更大的肾小球肥大。这些发现提示，早期应激与肾小球数密度改变相关，而这些改变伴随的代偿性重塑反应在断乳后代谢超负荷背景下更为明显。
