头尾环化与D-氨基酸取代重塑天然两栖动物肽的生物学活性

《Molecules》：Head-to-Tail Cyclization and D-Amino Acid Substitution Redesign the Biological Activities of a Naturally Occurring Amphibian Peptide

　　

肽工程已成为优化天然肽的强大策略。本研究选取来自Boana pulchella的两栖动物皮肤肽Hp-1891作为模型支架，考察两种互补工程策略——位点特异性D-氨基酸取代与头尾环化——的效应。研究人员通过基于9-芴甲氧羰基（Fmoc）的固相肽合成技术构建了含十二种类似物的文库，并评估了其对乙酰胆碱酯酶（AChE）、丁酰胆碱酯酶（BChE）及严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）主蛋白酶（Mpro）的抑制活性，同时测定了抗氧化活性和溶血活性。研究人员采用圆二色谱和分子建模探究所观察生物学效应背后的结构基础。头尾环化一致性地增强了AChE、BChE和Mpro的抑制活性，而D-氨基酸取代对抗氧化活性和溶血的影响更为显著。在类似物文库中，c-Hp-d2成为最具前景的多功能肽，其对三种酶均表现出增强的抑制作用，同时与天然肽相比溶血活性降低。结构分析表明，环化促进了构象组织化，而D-氨基酸掺入降低了α-螺旋倾向。上述发现证明，理性肽工程可有效重塑两栖动物肽的生物学谱，并凸显头尾环化作为生成具有治疗潜力的多功能肽支架的通用策略。

论文解读

一、研究背景与科学问题

肽类分子因其高靶标特异性、强生物学活性、良好安全性以及可调控蛋白-蛋白和蛋白-酶相互作用的能力，已成为现代药物发现中最具前景的治疗分子类别之一。然而，天然肽本身往往存在蛋白酶降解敏感、构象柔性过高、膜选择性差等固有局限，限制了其直接成药性。因此，肽研究的核心挑战不仅在于发现新的天然序列，更在于如何通过理性改造重塑已有肽结构，以拓宽其功能谱和治疗潜力。在这一范式下，肽工程应运而生——以天然进化的序列为起始模板进行分子优化。其中，D-氨基酸取代和肽环化是两种最成熟的优化策略：D-氨基酸的掺入可提高抗蛋白酶降解能力并改变肽构象、膜相互作用和靶标识别；环化则通过预组织生物活性构象降低构象柔性，从而改善靶标亲和力和生物学效力。

两栖动物皮肤分泌物是结构多样的生物活性分子最丰富的来源之一，其肽类具有抗菌、抗病毒、抗癌、免疫调节、抗氧化和酶抑制等多种活性。此前已有研究鉴定并表征了源自Boana pulchellus皮肤分泌物的19残基阳离子α-螺旋肽Hp-1891，该肽具有强抗菌活性，但同时表现出显著的溶血和细胞毒性，限制了其直接治疗应用。然而，这些特性恰好使其成为研究理性结构修饰如何重塑天然肽生物学行为的理想模型支架。目前，系统比较两种互补工程策略在同一天然肽支架上如何重塑功能景观的研究仍相对有限，这正是本研究开展的核心动因。

二、研究内容与总体结论

研究人员以Hp-1891为模型支架，通过Fmoc固相肽合成技术构建了一个含十二种类似物的文库：包括天然线性肽及其头尾环化对应物，以及五种含不同数量和分布模式D-亮氨酸取代的线性类似物及其相应环化衍生物。取代位点集中在预测的两亲性α-螺旋中央疏水簇中的Leu9、Leu10、Leu13和Leu14，而其余亮氨酸残基被有意保留以维持天然支架的整体结构同一性。研究人员系统评估了这些类似物对AChE、BChE和SARS-CoV-2 Mpro的抑制活性，以及抗氧化和溶血活性，并结合圆二色谱和分子建模阐明结构基础。总体结论是：头尾环化是酶抑制活性的主要结构决定因素，一致性地增强了对三种酶的抑制；D-氨基酸取代则主要影响抗氧化活性和溶血特性。两种策略在重塑肽功能方面发挥互补作用，证明了理性肽工程可有效将天然两栖动物肽转化为多功能治疗支架。

三、关键技术与方法

研究人员采用的主要技术方法包括：基于Fmoc的固相肽合成（SPPS）技术合成线性肽（C末端酰胺化）和头尾环化肽（经2-氯三苯甲基氯树脂制备线性前体后高稀释条件下进行内酰胺化）；反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化与MALDI-TOF质谱鉴定；圆二色谱（CD）分析二级结构；DPPH自由基清除实验评估抗氧化活性；Ellman法测定胆碱酯酶抑制活性；比色终点法测定Mpro抑制活性；人红细胞溶血实验评估膜毒性；Rosetta构象采样与AMBER显式溶剂分子动力学（MD）模拟进行结构建模；HADDOCK半柔性对接结合PRODIGY独立重评分预测肽-酶结合模式；ShineMD轨迹分析与接触占有率计算。样本来源方面，人红细胞分离自肝素化血液。

四、研究结果

4.1 理性设计与结构物化分析。 设计策略基于Hp-1891（H-RLGTALPALLKTLLAGLNG-NH₂），采用渐进式设计以评估立体化学修饰程度递增的效应。物化分析显示，环化将pH 7.4下的净电荷从+2.989降至+1.999，分子量从1891.339变为1874.308 Da，可旋转键数从62降至26。环化肽的RP-HPLC保留时间（20.75–23.60 min）显著长于线性肽（4.63–6.24 min）。PeptiVerse预测显示环化肽的渗透性相关参数优于线性肽。

4.2 胆碱酯酶抑制活性。 在400 μM固定浓度筛选中，线性D-取代类似物对AChE的抑制均低于30%，而环化显著增强抑制活性，c-Hp-1891达到近80%抑制。BChE方面，所有环化肽均产生60–80%的抑制。剂量-反应分析确定c-Hp-1891对AChE的IC₅₀为91.5 μM，c-Hp-d2为310.6 μM；BChE方面所有环化类似物均有可测活性，IC₅₀范围为45.5–149.1 μM。MD模拟显示环化稳定了结合态，线性肽的平均肽RMSD显著高于环化肽。

4.3 与AChE的预测相互作用。 以TcAChE为模型，c-Hp-1891通过环化在gorge入口组织了一个分布式外周相互作用界面，涉及Trp279、Tyr70、Tyr334等外周阴离子位点残基，形成持续接触网络而非单一锚定接触。

4.4 与BChE的预测相互作用。 c-Hp-d1在hBChE中埋藏分数从31.1%增至45.5%，质心沿Tyr332-Ser198轴位移约11.1 ?，表明更深的gorge容纳。接触网络同时涉及外周识别残基（Tyr332、Asp70）和更深区域残基（Trp82、Phe329、Gly116等）。

4.5 Mpro抑制活性。 在800 μM浓度下，c-Hp-d2表现出最高抑制活性（63.0%），较其线性对应物Hp-d2（7.1%）提高约9倍，较天然肽（28.3%）提高逾两倍，IC₅₀为332 μM。

4.6 与Mpro的预测相互作用。 c-Hp-d2在催化中心10 ?范围内的肽重原子分数从5.3%增至16.7%，五个残基占据催化环境。Leu13/D-Leu14片段与催化二联体His41及Glu166、Gln189等底物识别残基形成持续接触，支持非共价占据底物识别裂隙的机制。

4.7 抗氧化活性。 天然肽DPPH清除活性极弱（2.5%），而Hp-d3和Hp-d4分别达到约21.6%和24.8%，c-Hp-d1成为文库中最活跃肽（32.2%）。

4.8 溶血活性。 天然Hp-1891在100 μM时几乎完全裂解红细胞。D-亮氨酸取代普遍降低溶血，其中同时取代L9、L13和L14效果最显著。c-Hp-d3和c-Hp-d5在整个浓度范围内几乎无溶血。环化本身不足以改善膜选择性，溶血行为主要由D-Leu的数量和位置决定。

4.9 圆二色谱。 水溶液中环化肽c-Hp-1891保持更有序的α-螺旋构象，而D-取代类似物在TFE中螺旋信号减弱，表明D-氨基酸掺入局部破坏螺旋形成。

五、讨论总结与结论翻译

讨论总结： 研究揭示了环化与D-氨基酸取代在Hp-1891支架上的互补作用机制。环化通过构象预组织增强酶抑制，但其结构后果具有靶标依赖性：在AChE中主要重组外周界面，在BChE中实现更深的gorge容纳，在Mpro中增加催化环境占据。D-Leu取代则微调环化肽表面的几何形状而非作为统一增强活性的修饰。溶血与酶抑制的机制解耦表明，理性肽工程可独立调节生物学效力和膜选择性。

结论翻译： 本研究表明Hp-1891是理性肽工程的多功能分子支架。通过位点特异性D-氨基酸取代和头尾环化构建的十二种类似物文库揭示，两种策略对肽功能发挥互补效应。环化增强了AChE、BChE和SARS-CoV-2 Mpro的抑制活性，而D-氨基酸掺入主要调节抗氧化活性、二级结构和毒性。上述发现共同确立了理性肽工程作为将天然两栖动物肽转化为多功能支架的有效方法，并为下一代肽类治疗药物的开发提供了有用的设计原则。