脂质组学分析揭示卵巢癌小鼠模型中巨噬细胞分期相关的甘油三酯积累（Triglyceride Accumulation）

《Cancers》：Lipidomic Profiling Reveals Stage-Associated Triglyceride Accumulation in Macrophages in a Mouse Model of Ovarian Cancer

　　

背景/目的：肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages, TAMs）是卵巢癌免疫抑制性肿瘤微环境的关键介质。然而，巨噬细胞在卵巢肿瘤不同发展阶段的脂质代谢特征仍知之甚少。方法：研究人员对肿瘤细胞接种后第10天、第40天和第80天分离自ID8荷瘤C57/BL6小鼠的CD11b⁺/F4/80⁺巨噬细胞进行了基于液相色谱-质谱联用（LC-MS）的脂质组学分析。结果：主成分分析（Principal component analysis, PCA）和层次聚类分析揭示了巨噬细胞脂质谱中与分期相关的差异。磷脂酰乙醇胺（Phosphatidylethanolamine, PE）、磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）和溶血磷脂酰胆碱（Lysophosphatidylcholine, LPC）在较早时间点相对更丰富，而甘油三酯（Triglyceride, TG）种类在第80天分离的巨噬细胞中更丰富。详细分析显示，在第80天，具有更多总双键数的TG种类丰度增加。通路分析确定了第80天甘油磷脂代谢（glycerolipid metabolism）的富集。与这些脂质组学发现一致，第80天的巨噬细胞表现出脂质生成调节因子（包括Fasn、Pparg和Srebp1）表达增加，同时伴有与促肿瘤巨噬细胞状态相关的基因表达谱。向巨噬细胞补充油酸（oleic acid, OA）可增加与该巨噬细胞状态相关的选定基因的表达，支持脂质代谢改变与巨噬细胞基因表达变化之间的潜在关系。结论：这些发现确定了小鼠卵巢癌模型中巨噬细胞脂质代谢的分期相关TG积累和改变，并为未来研究确定巨噬细胞脂质代谢是否促进促肿瘤巨噬细胞状态提供了基础。

**研究背景与问题**

卵巢癌是世界上最致命的妇科恶性肿瘤之一，晚期诊断和化疗耐药导致的复发是预后不良的主要原因。尽管手术和化疗策略有所进步，晚期卵巢癌患者的总体生存率仍然很低，其特征是高度免疫抑制的肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）和远处转移。在免疫抑制性TME中，肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）获得促肿瘤表型并促进远处转移，成为疾病进展的关键协调者。越来越多的证据表明，TAMs的代谢重编程在增强其促肿瘤特性中发挥重要作用。脂质在膜合成、能量储存和信号传导等 diverse 生物学功能中至关重要，在巨噬细胞中，脂质调节炎症反应、吞噬功能和免疫调节。卵巢癌微环境富含脂质，因此其中的巨噬细胞经过代谢重塑以适应代谢压力。脂肪酸合成、脂质摄取和脂质储存的改变可影响巨噬细胞功能以支持肿瘤细胞快速增殖。基于液相色谱-质谱联用（LC-MS）的脂质组学技术已能够全面识别和表征生物系统中的脂质种类，为疾病相关的脂质代谢改变提供更深入的见解。然而，卵巢肿瘤微环境中脂质谱变化如何影响巨噬细胞的促肿瘤特性尚不清楚。甘油三酯（triglyceride, TG）作为主要的甘油酯类，主要作为能量储存分子，近年来其在免疫细胞代谢中的作用日益受到重视。巨噬细胞内TG积累与脂滴形成增强、代谢灵活性和免疫抑制表型的采用有关。此外，TG种类中脂肪酸链长度和饱和度的改变可能影响脂质信号通路、膜特性和巨噬细胞极化。尽管有这些新见解，但在卵巢癌进展过程中TAMs中TG重塑的时间动态及其与整体脂质组学变化的关系尚未被充分表征。因此，研究人员开展了这项探索性研究，旨在表征肿瘤细胞接种后第10、40和80天从ID8荷瘤小鼠中分离的CD11b⁺/F4/80⁺巨噬细胞的脂质组成中与分期相关的差异。

**研究内容与结论**

该研究使用同基因小鼠卵巢癌模型，将ID8小鼠卵巢癌细胞腹腔注射至雌性C57/BL6小鼠，在注射后第10、40和80天分离CD11b⁺/F4/80⁺巨噬细胞。脂质组学分析揭示了不同时间点巨噬细胞脂质谱的显著差异，特别是晚期（第80天）TG丰度显著增加。同时，晚期巨噬细胞中脂质合成和储存相关基因（如Fasn、Pparg和Srebp1）表达上调，脂肪酸氧化基因Cpt1a表达下调，并伴随促肿瘤巨噬细胞状态相关基因（如Ccl22、Cd163）表达增加和Nos2表达减少。体外实验证实，外源性油酸处理可诱导巨噬细胞中性脂质积累并促进促肿瘤表型相关基因表达。这些发现确定了卵巢癌进展过程中巨噬细胞脂质代谢的阶段相关改变，为未来研究巨噬细胞脂质代谢在促肿瘤巨噬细胞状态和肿瘤进展中的作用提供了基础。

**主要关键技术方法**

研究人员使用了以下关键技术方法：（1）ID8小鼠卵巢癌同基因模型，在第10、40和80天收集腹腔巨噬细胞或腹水中的CD11b⁺/F4/80⁺巨噬细胞，前两个时间点使用硫代乙醇酸盐腹腔注射招募巨噬细胞，第80天直接从腹水收集；（2）基于LC-MS的脂质组学分析，利用Q Exactive Plus质谱仪和ACQUITY H-Class液相色谱系统，采用MTBE法提取脂质，使用EquiSPLASH氘代脂质混合物作内标，数据通过LipidSearch 5软件处理；（3）RAW 264.7巨噬细胞系用于体外油酸处理实验，通过BODIPY/LipidTOX染色评估中性脂质积累；（4）实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测脂质代谢和巨噬细胞表型相关基因表达。

**研究结果**

**3.1 在ID8肿瘤细胞注射后的三个时间点，CD11b⁺/F4/80⁺巨噬细胞表现出不同的脂质类别分布**

通过主成分分析（PCA）和层次聚类分析，第10、40和80天的巨噬细胞整体脂质谱存在差异。脂质类别分析显示，第80天神经酰胺（Cer）、心磷脂（CL）、溶血磷脂酰肌醇（LPI）、甲基磷脂酰胆碱（MePC）、缩醛磷脂酰乙醇胺（PEt）、鞘磷脂（SM）、单甘油酯（MG）、甘油二酯（DG）和甘油三酯（TG）等类别丰度增加，而酰基肉碱（AcCa）、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）和磷脂酰丝氨酸（PS）等类别丰度降低。

**3.2 CD11b⁺/F4/80⁺巨噬细胞在第80天显示TG种类丰度增加**

Z-score分析显示多种TG和Cer种类在第80天富集。脂质类别相对贡献分析表明，TG在第80天占总脂质丰度的近50%，成为优势脂质类别。火山图分析确认多个TG种类在第80天显著丰度增加。KEGG通路富集分析显示，第80天甘油磷脂代谢（glycerolipid metabolism）是最富集的通路。

**3.3 高度不饱和和长链TG种类在第80天分离的CD11b⁺/F4/80⁺巨噬细胞中含量丰富**

对TG种类的进一步分析显示，第80天总酰基碳链更长（>50）的TG种类丰度增加，且含≥2个总双键的高度不饱和TG种类占第80天检测到的TG种类的近90%。脂质类别与不饱和度分析显示，TG、DG、MG等在第80天趋向于更高不饱和度分布。

**3.4 第80天的CD11b⁺/F4/80⁺巨噬细胞显示脂质代谢和促肿瘤巨噬细胞相关转录本表达增加**

RT-qPCR分析显示，第80天巨噬细胞中脂质合成调节因子Fasn、Pparγ和Srebp1表达增加，脂肪酸氧化基因Cpt1a表达降低。同时，促肿瘤巨噬细胞表型相关基因Ccl22和Cd163表达增加，Nos2表达减少。

**3.5 油酸处理增加了RAW264.7巨噬细胞的中性脂质积累和促肿瘤表型相关基因的表达**

体外实验证实，油酸（OA）处理RAW 264.7巨噬细胞24小时后， LipidTOX染色显示中性脂质积累增加，同时Arg1和Cd163表达上调，Nos2表达下调。

**讨论与结论**

研究讨论部分指出，第80天巨噬细胞中TG丰度显著增加，约占脂质总量的一半，表明晚期肿瘤阶段巨噬细胞中性脂质储存增加。脂滴积累已在多种癌症的巨噬细胞中被报道，并与促肿瘤巨噬细胞功能相关。长链和高不饱和TG种类的富集表明脂肪酸延伸和去饱和可能参与其中，这可能影响膜流动性、脂质信号传导和代谢灵活性。此外，从早期时间点的膜相关脂质类别（如PC、PG）向晚期储存脂质类别（如TG）的转变，提示肿瘤进展过程中巨噬细胞从膜合成向脂质储存的代谢重编程。基因表达分析支持脂质代谢改变与促肿瘤巨噬细胞状态之间的关联。然而，研究存在局限性，包括不同时间点使用不同巨噬细胞分离方法（硫代乙醇酸盐诱导与直接收集腹水）可能引入混杂因素，缺乏年龄匹配的无肿瘤对照组，仅三个生物学重复限制了统计效力，以及横断面设计无法区分代谢适应与巨噬细胞群体组成变化。相关性网络分析虽揭示脂质种类间的关联，但不代表直接生化相互作用。总体而言，这些发现是探索性和描述性的。

研究结论：综合来看，研究人员的研究结果确定了来自ID8荷瘤小鼠的CD11b⁺/F4/80⁺巨噬细胞脂质组学谱的分期相关改变，包括TG丰度增加。这些发现伴随脂质合成和储存相关基因表达的变化，以及与促肿瘤巨噬细胞状态相关的基因表达谱。这些结果为未来研究确定巨噬细胞脂质代谢是否促进促肿瘤巨噬细胞状态和卵巢癌进展奠定了基础。