《Neuron》：Loss of interruption in the HTT CAG repeat is associated with somatic expansion and loss of medium spiny neurons in Huntington’s disease
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亨廷顿蛋白（Huntingtin, HTT）扩增的CAG重复序列中的同义丢失中断变异可加速亨廷顿病（Huntington’s disease, HD）的临床发病与进展。中型多棘神经元（medium spiny neurons, MSNs）在HD中逐渐丢失，并发
亨廷顿蛋白（Huntingtin, HTT）扩增的CAG重复序列中的同义丢失中断变异可加速亨廷顿病（Huntington’s disease, HD）的临床发病与进展。中型多棘神经元（medium spiny neurons, MSNs）在HD中逐渐丢失，并发生选择性的体细胞CAG扩增，但尚不清楚体细胞扩增与MSN病理之间的关系。在此，研究人员表明，在早期显性HD中，具有大（111–150 CAG）和特大（>150 CAG）体细胞扩增的MSNs较为罕见，但随病程延长而按比例累积。在携带有害的CAG-CCG丢失中断（CAG-CCG loss-of-interruption, CAG-CCG LOI）修饰因子的患者中，尽管血液中的小体细胞扩增减少，但具有大和特大扩增的MSNs比例增加约5倍，且尾状核MSN数量减少。研究结果表明，增加的体细胞CAG扩增有助于加速纹状体MSN病理和HD发病，但具有极大基因组CAG扩增的MSNs可在HD脑的存活神经元中持续存在。
亨廷顿病（Huntington’s disease, HD）是一种致命的重复扩增疾病，以进行性运动障碍、精神异常、认知衰退和纹状体选择性退化为特征，由亨廷顿蛋白基因（Huntingtin, HTT）外显子1中36个以上不间断的CAG重复引起。遗传的CAG重复长度是发病年龄的主要决定因素。HTT CAG重复在不同组织和细胞类型中发生不同程度的体细胞扩增，其中选择性丢失的纹状体神经元中扩增最为显著，提示体细胞扩增可能参与HD的发病。然而，体细胞扩增与HD表型之间的直接关联尚不明确。已知HD的遗传修饰因子多为DNA错配修复基因，但效应较温和。相比之下，HTT外显子1内的CAG-CCG丢失中断（CAG-CCG LOI）变异是目前已知最强的HD修饰因子，可提前发病最多12.5年并加速疾病进展，并可在前驱期即加速纹状体萎缩，但其致病机制未知。研究人员推测该变异可能通过改变脆弱神经元中的体细胞CAG扩增来加速病理，但既往研究主要基于血液，不能代表脑内受影响区域的扩增动态。为此，研究人员利用互补方法评估了外周血、死后脑组织及分离的MSN中HTT CAG体细胞扩增，并量化了CAG-CCG LOI供体尾状核中的MSN丢失。结果发现，CAG-CCG LOI变异不增加血液或总体脑组织中可检测的小体细胞扩增，却强烈增加MSN中大（111–150 CAG）和特大（>150 CAG）体细胞扩增的比例，并加速MSN丢失。该研究表明，HTT CAG重复区域的局部遗传改变可通过影响脆弱人类脑细胞类型中的大扩增速率来修饰HD病理，论文发表于《Neuron》。
研究人员为开展研究使用了以下主要关键技术方法（样本队列来自UBC HD生物库、鲁尔大学波鸿和奥克兰大学）：利用超深度MiSeq短读长测序和片段分析检测血液及脑组织中的小体细胞扩增，计算第一扩增比（FER）和体细胞扩增比（RSE）；开发三引物小池PCR（TPSP-PCR）在单分子水平检测CAG重复长度，可定量大和特大扩增；采用荧光激活核分选（FANS）依据DRD1、DRD2和PPP1R1B RNA探针分离尾状核MSN核；对尾状核切片进行DARPP-32免疫荧光和Nissl染色计数MSN。
结果部分如下：
**血液中的小体细胞CAG扩增与发病年龄无关，且在CAG-CCG LOI变异HD患者中减少**
对125例canonical序列和24例CAG-CCG LOI变异供体的血液DNA分析显示，小体细胞扩增随CAG重复长度和年龄增加，但校正后与发病年龄无相关性。CAG-CCG LOI供体血液中的残余RSE显著低于canonical供体（p = 3.8 × 10
-4），表明该变异在血液中反而减少小扩增。
**CAG-CCG LOI变异不增加HD患者总体脑组织中的小体细胞扩增频率**
比较34例canonical和11例CAG-CCG LOI供体的尾状核、壳核、额叶皮层和小脑，发现各区域体细胞扩增随CAG长度增加，但CAG-CCG LOI在壳核中RSE降低（p = 0.026），尾状核有降低趋势，额叶皮层和小脑无差异。总体脑组织中的小扩增也未因该变异增加。
**TPSP-PCR检测到HD尾状核中的大CAG体细胞扩增并富集于MSN**
新开发的TPSP-PCR可从单基因组水平定量检测大和特大扩增。在总体尾状核中，大扩增随遗传CAG长度增加，但CAG-CCG LOI无显著效应。经FANS分选的PPP1R1B（DARPP-32）阳性MSN核中，>150 CAG的特大扩增频率高达10%–20%，而在短读长测序中无法检测，表明该技术能特异性检测MSN中富集的稀有长扩增。
**MSN中的大体细胞扩增随病程和CAG-CCG LOI基因型按比例增加**
对D1 MSN的单分子CAG分布分析显示，canonical供体中大（111–150）和特大（>150）扩增比例随病程增加。例如病程1年时分别为3.4%和0.8%，15年时增至10.7%和16.1%。在CAG-CCG LOI供体中，匹配病程和遗传CAG长度时，大和特大扩增比例较canonical增加约5倍，且随病程进一步增加，病程10年时58.9%的MSN具有>150 CAG扩增。线性混合模型显示CAG-CCG LOI基因型是MSN体细胞扩增最强的预测因子（p = 2.18 × 10
-10），D1和D2 MSN间无显著差异。
**CAG-CCG LOI与更早的MSN丢失和更早的DRD2+ MSN耗竭相关**
对尾状核切片DARPP-32+细胞计数显示，CAG-CCG LOI供体各病程阶段MSN比例均显著低于canonical供体（p = 4.37 × 10
-4），且DARPP-32信号强度降低（p = 4.7 × 10
-5）。在MSN亚群中，CAG-CCG LOI供体的DRD2+ MSN比例随病程下降更快（p = 4.77 × 10
-3），表明间接通路D2 MSN丢失加速。
在讨论部分，研究人员指出，尽管>150 CAG扩增在早期canonical MS N中极罕见（<1%），但可随病程和CAG-CCG LOI累积，说明带有极大扩增的MSN可在脑内持续存在，而非立即死亡。血液DNA不能反映脑内MSN的体细胞扩增，因此作为疾病相关扩增的生物标志物价值有限。此外，分选方法依赖PPP1R1B表达，该基因在>150 CAG的MSN中下调可能造成低估，但不影响主要结论。研究人员强调，合适的HD动物模型需要包含体细胞扩增才能准确模拟患者病理。该研究不能排除CAG-CCG LOI通过其他机制（如RNA毒性、非AUG重复相关翻译等）发挥作用，但结论显示，对HTT CAG重复区域进行局部遗传改变可改变脆弱细胞类型中的扩增，从而修饰HD发病。结论为：CAG-CCG LOI与HD纹状体MSN中大扩增比例增加、MSN数量降低及间接通路D2 MSN更早丢失相关；外周血DNA不能捕捉MSN中的扩增增加，提示血液DNA不是反映HD神经元中疾病相关体细胞扩增的良好生物标志物。
