**基于生物合成规则的推定注释策略揭示山莨菪（*Anisodus luridus*）组织特异性莨菪烷类生物碱与苯丙素类多胺生物碱谱**

《Metabolites》：Biosynthesis-Informed Putative Annotation Reveals Alkaloid Profiles Across Tissues of Anisodus luridus

　　

**背景/目的：** 莨菪烷类生物碱（tropane alkaloids, TAs）与苯丙素类多胺生物碱（phenylpropanoid polyamine alkaloids, PPAs）是茄科植物的主要生物碱成分；然而，这些化合物在产自西藏东南部的药用植物山莨菪（*Anisodus luridus*）中的组织特异性分布尚未得到充分表征。**方法：** 研究人员开发了一种基于生物合成信息的推定注释工作流程，采用超高效液相色谱–高分辨质谱（ultra-performance liquid chromatography–high-resolution mass spectrometry, UPLC-HRMS）对七种组织（根、茎、叶、花萼、花冠、子房和种子）中的生物碱谱进行表征。推定注释以底物–产物结构关系、预测的酶催化修饰以及诊断性串联质谱（tandem mass spectrometry, MS/MS）碎裂模式为指导。**结果：** 共表征了18个生物碱特征，包括6种TAs和12种PPAs。利用标准品鉴定了莨菪碱（hyoscyamine）和东莨菪碱（scopolamine），其余16个特征为推定注释，包括二氢阿尼索达明（dihydroanisodamine）、己糖基莨菪碱（hexosylhyoscyamine）以及若干此前在山莨菪中未见报道的PPAs。TAs主要富集于根和子房中，而PPAs则在花组织和叶中积累。正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA）确定东莨菪碱（变量投影重要性（variable importance in projection, VIP）= 1.30）为与组织代谢谱分离相关的主要变量。**结论：** 该工作流程支持非模式药用植物中生物碱的推定注释。所观察到的组织特异性分布模式为未来与颠茄（*A. belladonna*）的比较研究以及栽培、组织选择性采收和提取策略的评估提供了基础。

## 基于生物合成规则的代谢物注释策略解析山莨菪组织特异性生物碱谱——论文解读

### 一、研究背景与科学问题

莨菪烷类生物碱（tropane alkaloids, TAs）是一类具有抗胆碱能活性的特殊代谢产物，其代表化合物莨菪碱（hyoscyamine）和东莨菪碱（scopolamine）在临床上被广泛用作解痉剂和镇痛剂。颠茄（*Atropa belladonna*）是目前TAs的主要工业来源，但其总TA含量仅介于0.2%至2%之间，且植株内莨菪碱向东莨菪碱的转化效率有限，加之地理和气候条件限制导致提取成本高昂，产能难以满足持续增长的全球需求。近年来，合成生物学研究虽已在酵母中实现了TAs途径的异源重建，但产量仅为30–80 μg·L^?1，远未达到商业化水平。因此，寻找生物量充足、生物碱含量较高且具有栽培潜力的替代药用植物，对于缓解TAs供应瓶颈具有重要意义。

山莨菪属（*Anisodus*）是泛喜马拉雅地区特有的TAs富集类群，其中山莨菪（*Anisodus luridus*）在传统藏医药中与山莨菪（*A. tanguticus*）一同作为"唐冲那保"使用，用于治疗寄生虫感染、狂症、黄水病和炭疽等疾病。然而，与分布广泛且研究相对充分的山莨菪（*A. tanguticus*）相比，产于西藏东南部的山莨菪（*A. luridus*）作为药用资源的研究明显不足。前期研究显示，山莨菪子房中莨菪碱和东莨菪碱含量最高分别可达18.93和3.14 mg·g^?1干重，均高于颠茄的报道值；且东莨菪碱的中枢活性约为阿托品（atropine）的十倍，使得山莨菪成为极具潜力的补充性工业来源。此外，苯丙素类多胺生物碱（phenylpropanoid polyamine alkaloids, PPAs）在山莨菪属植物中亦具有化学多样性——已从山莨菪（*A. tanguticus*）根中分离获得11种酰胺类生物碱，以及具有丁酰胆碱酯酶抑制和抗氧化活性的巨环双咖啡酰精胺类化合物。枸杞（*Lycium barbarum*）中发现的系列双咖啡酰精胺衍生物（lycibarbarspermidines A–S）具有神经保护和抗氧化活性，而库科胺A（kukoamine A）在神经毒素诱导的帕金森病模型中亦表现出神经保护效应，这些发现为系统挖掘山莨菪中的PPAs类成分提供了合理依据。

尽管TAs和PPAs可能在山莨菪中共同存在，但现有研究多集中于少数目标化合物的定量分析，缺乏跨多组织的化学成分系统表征。传统基于硅胶柱色谱或制备型高效液相色谱（HPLC）结合核磁共振（NMR）的天然产物研究流程，单个TA中间体的分离鉴定即需耗时2–3个月，难以实现高通量分析。超高效液相色谱–高分辨质谱（UPLC-HRMS）虽具备高通量和高分辨率的优势，但常规代谢组学分析面临两大瓶颈：依赖商业谱库和标准品导致大量特征无法注释，以及缺乏生物学导向的优先级排序使得在海量数据中识别目标化合物变得困难。将生物合成逻辑整合到数据分析中——例如利用已建立的生物合成途径作为框架，根据预测的酶催化修饰（如羟基化或糖基化引起的保留时间偏移）和特征性串联质谱（MS/MS）碎裂模式进行推定注释——有望克服上述局限。

在此背景下，研究人员选取山莨菪（*A. luridus*）为研究对象，开发了一种基于生物合成信息的推定注释工作流程，以TA和PPA生物合成途径为理论框架，综合运用底物–产物结构关系、预测酶催化修饰和诊断性MS/MS碎裂模式，对七个组织部位的生物碱谱进行了系统表征和比较分析。

### 二、关键技术与方法概要

本研究采用的核心技术方法如下：（1）植物材料方面，六年生栽培山莨菪的根、茎、叶、花萼、花冠和子房于盛花期（7月）采集自西藏林芝栽培基地（海拔约3005米），种子于成熟期（9月）从同一地点的另一组植株采集；每种组织来自15株个体，随机分为5组（每组3株混合），构成5个生物学重复。（2）代谢物提取采用70%甲醇水溶液超声辅助萃取，冻干样品与溶剂比例为20 mg·mL^?1。（3）分析平台采用Acquity H-Class UPLC系统串联Xevo G2-XS四极杆飞行时间质谱仪（Q-TOF），色谱分离使用BEH C₁₈色谱柱（2.1 × 50 mm, 1.7 μm），在正离子电喷雾电离模式下采集数据。（4）数据处理采用Progenesis QI软件进行峰检测、对齐、基线校正和归一化，生成归一化峰面积矩阵；公共数据库（MONA、PubChem）检索辅助初步注释。（5）以莨菪碱和东莨菪碱标准品为参照（代谢组学标准倡议（MSI）1级鉴定），其余特征基于MS/MS谱图证据、数据库匹配和生物合成逻辑进行MSI 2级或3级推定注释。（6）采用OPLS-DA（SIMCA-P软件）建模和变量投影重要性（VIP > 1）筛选区分不同组织代谢谱的关键变量，利用单因素方差分析（ANOVA）结合Duncan多重比较检验评估组织间差异显著性，并通过TBtools-II软件绘制热图展示组织特异性积累模式。

### 三、主要研究结果

**3.1 山莨菪各组织的总离子流谱特征**

七种组织样本的UPLC-HRMS总离子流（total ion current, TIC）色谱图在峰数量、丰度和保留时间分布上均表现出明显差异。子房、花冠、花萼和叶的谱图轮廓较为相似，在3–7分钟区间出现大量色谱峰，而其他组织的检出峰较少。PPAs相关信号主要集中在约4–6分钟区间，TAs相关信号则集中于约5–7分钟区间。东莨菪碱（保留时间RT = 5.88 min）、阿尼索达明（anisodamine, RT = 6.01 min）和莨菪碱（RT = 6.71 min）的信号在所有组织中均有检出，但相对峰面积存在差异。咖啡酰腐胺（caffeoylputrescine，RT = 4.30 min）的信号在子房、花冠、花萼和叶中具有较高的相对峰面积。上述结果表明生物碱相对丰度存在组织相关性变异，为后续系统分析提供了依据。

**3.2 基于生物合成规则的TAs和PPAs推定注释**

研究人员以莨菪碱为核心途径产物参照，结合前人已明确的酶催化修饰类型（羟基化、环氧化、N-去甲基化和糖基化），共表征了6个TA特征。莨菪碱和东莨菪碱经标准品比对确认为MSI 1级鉴定。阿尼索达明因含额外羟基，保留时间较莨菪碱提前（RT = 6.01 min），其MS/MS谱中羟基化托品环碎片离子为m/z 140.105。二氢阿尼索达明（dihydroanisodamine，RT = 5.45 min）首次在山莨菪中被推定注释，其二羟基托品环碎片为m/z 156.101。东莨菪碱含有环氧基团，保留时间（5.88 min）介于阿尼索达明和二氢阿尼索达明之间，碎片m/z 156.101支持含环氧托品环结构。去甲莨菪碱（norhyoscyamine）被推定为莨菪碱的去甲基化衍生物（RT = 6.62 min）。己糖基莨菪碱（hexosylhyoscyamine）亦首次在该物种中被推定注释，其较短保留时间（6.12 min）以及162 Da（己糖部分）和165 Da的连续中性丢失、最终产生托品环碎片m/z 124.111的特征，均支持该推定。

PPAs候选物以腐胺（putrescine）和精胺（spermidine）为生物合成前体，BAHD家族酰基转移酶可引入肉桂酰基、对香豆酰基、咖啡酰基和阿魏酰基等苯丙素类基团。单苯丙素类腐胺的保留时间随酰基侧链羟基数增加而递减：肉桂酰腐胺（无羟基，RT = 6.99 min）> 对香豆酰腐胺（一个羟基，RT = 4.66 min）> 咖啡酰腐胺（两个羟基，RT = 4.27 min），相应的特征酰基碎片分别为m/z 131.047、147.044和163.038。二氢咖啡酰腐胺（dihydrocaffeoylputrescine，RT = 3.46 min）产生特征碎片m/z 165.054。双苯丙素类精胺（包括scotanamine系列）利用逐步碎裂模式——先丢失酰基腐胺片段、再发生57 Da中性丢失——进行推定注释和位置异构体区分。例如，双咖啡酰精胺（dicaffeoylspermidine，RT = 6.20 min）产生m/z 220.096和163.038碎片，均与咖啡酰基团一致；scotanamine D（RT = 6.08 min）产生m/z 222.113（二氢咖啡酰基团）和310.214（咖啡酰精胺片段），支持杂合结构推定；N¹-咖啡酰-N³-二氢咖啡酰精胺（RT = 5.95 min）亦基于特征碎片组合被推定注释。

**3.3 18种生物碱在代谢网络中的映射**

将18个生物碱注释映射至以鸟氨酸（ornithine）和苯丙氨酸（phenylalanine）为起点的代谢网络，结果与从共同中间体腐胺出发的分支特化模式一致。网络涵盖三个拟议分支：（1）TA分支，由腐胺N-甲基转移酶（putrescine N-methyltransferase, PMT）催化形成N-甲基腐胺，经氧化环化生成托品烷骨架后与苯丙氨酸来源的酸基团酯化；（2）单苯丙素类腐胺分支，由BAHD家族酰基转移酶以咖啡酰辅酶A（caffeoyl-CoA）或相关酰基CoAs进行酰化生成；（3）双苯丙素类精胺分支，由腐胺转化为精胺后经酰化形成。该映射结果与山莨菪中上述拟议分支的共存一致，为未来与颠茄的比较研究提供了理论框架。

**3.4 18种生物碱的组织特异性积累模式**

归一化峰面积数据的热图分析显示两个主要聚类：聚类1包含TA特征（莨菪碱、阿尼索达明、己糖基莨菪碱等），在子房和根中的相对峰面积显著高于其他组织；聚类2包含PPA特征（咖啡酰腐胺、双咖啡酰精胺、scotanamine类化合物等），在花萼、叶和花冠中相对峰面积较高，而在根和种子中较低。种子样本与茎样本聚类，呈现中等TA含量和较低PPA含量的特征；但需注意种子于9月成熟期采集，而其他组织于7月盛花期采集，该差异可能同时反映组织特异性和发育阶段效应。

**3.5 OPLS-DA模型筛选与生物合成相关的差异性生物碱**

以18种生物碱的峰面积为变量构建OPLS-DA模型，前两个组分解释了78.6%的X变量方差（R²X [1] = 0.561; R²X [2] = 0.225）。所有样本均落在95% Hotelling T²椭圆内。得分图中，同组织样本紧密聚集，不同组织间则呈现分离趋势：花萼和子房样本位于图右侧，茎和根样本位于左侧。VIP分析（阈值 > 1）将东莨菪碱（VIP = 1.30）和去甲莨菪碱（VIP = 1.24）列为主要区分变量，表明TA相关信号的差异对不同组织代谢谱的区分贡献最大。

### 四、讨论总结与研究结论

在讨论部分，研究人员首先指出，非模式药用植物的非靶向液相色谱–高分辨质谱研究常因标准品和谱库资源有限而导致大量特征无法注释。为此，近年发展起来的分子网络平台（如GNPS）、代谢反应网络递归注释框架（如MetDNA、KGMN/MetDNA2、NetID）以及理论化学空间映射等策略，均将生物合成知识融入数据分析以降低注释不确定性。本研究所采用的工作流程在概念上借鉴了上述策略，聚焦于茄科两种特征性代谢物类别，将预期的酶催化转化与诊断性保留时间及MS/MS碎裂模式结合，实现了类别导向的推定注释，可在分类群特异性谱库资源有限的情况下为其他茄科非模式药用植物提供方法参考。

其次，研究人员重新审视了山莨菪的药用价值。此前研究主要关注TA含量和提取工艺，形成了以根为核心的质量评价体系——这一取向与山莨菪（*A. tanguticus*）中根组织TA含量高于地上部分以及颠茄中TA生物合成基因主要在侧根表达、产物向地上组织转运和沉积的报道相呼应。然而，本研究利用生物合成引导的注释策略，不仅确认了莨菪碱和东莨菪碱的存在，还推定了额外TA和PPA候选物，展现出比以往认知更为多样化的生物碱谱。两类化合物呈现明显不同的相对分布：TA相关信号在根和子房中较高，PPA相关信号在叶和花组织中较高。PPA苯丙素基团中的共轭双键可能赋予其抗氧化或光保护潜力，该模式与地上组织中PPA相对富集的观察相容；此外，水稻叶片中紫外辐射可诱导苯酰胺类积累的跨物种证据，为PPAs在山莨菪中的潜在生态功能提供了间接背景。枸杞中结构相关代谢物的神经保护活性报道则为山莨菪PPA候选物的后续生物活性测试提供了依据，但尚不能推定山莨菪中具有同等的活性。

关于研究局限，研究人员承认：（1）由于缺乏大多数分析物的标准品、内标和校准曲线，峰面积数据仅提供半定量的相对丰度而非绝对浓度，未来应采用定量核磁共振（qNMR）或稳定同位素标记内标法实现绝对定量；（2）混合制样策略虽保证了低丰度代谢物的检出，但无法评估个体间变异，后续应以单株为单位进行分析；（3）种子与其他组织的采样时期不同，所观察到的种子代谢谱可能同时受组织和发育阶段效应的影响；（4）PPA候选物拟议的神经保护和生态生理功能均基于结构相似性和跨物种证据，而非山莨菪提取物的直接测试，需通过生物活性导向分离、体内外实验和专门的胁迫生理学实验加以验证。

**研究结论：** 本研究应用基于生物合成信息的代谢组学工作流程，对山莨菪（*A. luridus*）中的生物碱特征进行了系统表征。共表征了18个生物碱特征（6种TAs和12种PPAs），其中莨菪碱和东莨菪碱经标准品鉴定确认，其余16个特征为推定注释。这些生物碱的相对峰面积在不同组织间存在差异。所观察到的分布模式为未来与颠茄（*A. belladonna*）的比较研究以及栽培、采收、提取和代谢工程研究提供了基础。在实际应用中，TAs相关信号在根和子房中相对富集、PPAs相关信号在叶和花组织中相对富集的规律，可指导栽培试验和组织选择性采收的靶组织选择。后续需开展跨发育阶段的靶向定量分析，并结合组织生物量和植株再生能力测定，以确定最佳采收时机、评估生物碱产量及重复采收的可行性。整合多组学网络重建与靶向验证，将为界定这些分布模式的调控基础及其实际应用价值提供系统层面的框架。