《Viruses》：Functional Evaluation of Neutralizing Antibodies Against Foot-and-Mouth Disease Virus Serotype O Using a Luciferase-Based Surrogate Neutralization Assay
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口蹄疫是一种严重威胁牲畜健康的高度传染性病毒性疾病。疫苗接种诱导的保护性免疫主要与中和抗体的产生有关；然而，传统的病毒中和试验耗时且需要处理活病毒，限制了其在常规环境中进行快速和重复评估的适用性。在本研究中，研究人员建立了一种用于功能性评估针对O型口蹄疫病毒（
口蹄疫是一种严重威胁牲畜健康的高度传染性病毒性疾病。疫苗接种诱导的保护性免疫主要与中和抗体的产生有关；然而，传统的病毒中和试验耗时且需要处理活病毒，限制了其在常规环境中进行快速和重复评估的适用性。在本研究中，研究人员建立了一种用于功能性评估针对O型口蹄疫病毒（FMDV）中和抗体活性的替代中和试验。该试验测量了将表达LgBiT的细胞暴露于HiBiT标记的病毒样颗粒（VLP）制剂后产生的基于荧光素酶的发光信号的变化。通过蔗糖梯度分级和电子显微镜证实，源自O型FMDV的VLP表现出与病毒粒子相似的稳定衣壳蛋白表达、组装特性和形态完整性。在中和抗体存在的情况下，观察到发光信号降低，从而能够对抗体活性进行功能性区分。该替代试验的结果与针对O型FMDV的传统病毒中和试验显示出强相关性（R2 = 0.9068）。本研究证明了替代中和试验在评估中和抗体功能活性方面的可行性，及其在疫苗免疫原性评估和功能性抗体分析中的潜在适用性。
论文解读文章
研究背景
口蹄疫是一种严重影响牛、猪等偶蹄类动物健康的烈性传染病，对全球畜牧业生产和国际贸易构成重大经济威胁。其病原体口蹄疫病毒（FMDV）包含七个血清型，其中O型分布最广，抗原变异也最为复杂。疫苗接种是防控口蹄疫的关键手段，而由疫苗诱导产生的中和抗体是衡量保护性免疫的重要指标。传统上，评估中和抗体水平依赖于病毒中和试验（VNT），但该方法需要使用活病毒，必须在高等级生物安全实验室中进行，且耗时长（通常需2-3天），不适用于大规模、快速的血清学筛查。因此，开发一种安全、快速、高通量的替代方法来评估中和抗体活性，对于疫苗效果评价和流行病学监测具有重要意义。
研究内容与结论
为解决上述问题，研究人员利用基于HiBiT和LgBiT的NanoBiT报告系统，建立了一种针对O型FMDV的替代中和试验。他们将HiBiT肽段分别插入到O型FMDV病毒样颗粒（VLP）的不同位点（VP4、VP1 BC环、VP1 GH环），通过比较发现，将HiBiT插入VP4蛋白（VP4-HiBiT）构建的VLP既能产生有效的发光信号，又能较好地保持颗粒结构的完整性和抗原表位的天然构象。在此基础上，研究人员建立了VP4-HiBiT VLP为基础的NanoBiT-VNT。通过对接种二价口蹄疫疫苗（含O/Boeun和A/Yeoncheon毒株）的猪只血清样本进行检测，结果显示该试验能够有效区分阴性和阳性血清，并能区分不同水平的中和抗体反应。更重要的是，对66份猪血清样本的对比分析表明，该NanoBiT-VNT与传统VNT测定的中和抗体滴度之间呈现出极强的正相关性（R2 = 0.9068）。这一研究证明，该基于VLP的替代中和平台可以作为一种安全、高效的替代方法，用于评估O型FMDV疫苗诱导的中和抗体反应，具有良好的应用前景。
关键技术方法
- 1.
HiBiT标记VLP的构建与表达： 研究人员将编码HiBiT肽段的序列插入FMDV O/PanAsia-2毒株的结构蛋白基因中，构建了三种重组质粒（VP4-HiBiT、VP1 BC-HiBiT、VP1 GH-HiBiT），并在人胚肾293T（HEK293T）细胞中瞬时表达，获得HiBiT标记的VLP。
- 2.
NanoBiT-VNT（替代中和试验）： 该方法是本研究的核心。将待检血清与含有HiBiT标记VLP的培养上清液孵育，然后将混合物转移至稳定表达LgBiT的LF-BK细胞系中。若血清中存在中和抗体，会阻止VLP与细胞结合，导致后续加入底物后产生的荧光素酶信号减弱。通过计算发光信号的抑制率来确定中和抗体滴度。
- 3.
传统病毒中和试验（VNT）： 作为金标准对照方法，研究人员按照WOAH《陆生动物诊断试验与疫苗手册》的规定，使用活的O/ME-SA/PanAsia-2病毒株和LF-BK细胞进行经典的微量中和试验。
- 4.
VLP表征与纯化： 通过Western印迹法确认HiBiT标签的表达，使用蔗糖密度梯度超速离心纯化VLP，并通过透射电子显微镜观察VLP的形态完整性。此外，还使用了阻断ELISA试剂盒检测血清中的结构蛋白抗体。
研究结果
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HiBiT标记的O型FMDV VLP的构建
研究人员设计了三种将HiBiT序列插入O型FMDV结构蛋白不同位点的质粒。这些位点（VP4第37位氨基酸、VP1 BC环第51位氨基酸、VP1 GH环第153位氨基酸）被认为是表面暴露或结构上允许插入而不破坏衣壳组装的区域。
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HiBiT表达和NanoBiT报告活性的评估
通过Western印迹和荧光素酶活性检测发现，VP4-HiBiT和VP1 GH-HiBiT构建体均能表达HiBiT蛋白并产生显著的发光信号，其中VP1 GH-HiBiT的信号最强。而VP1 BC-HiBiT构建体的表达和信号均较弱。
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HiBiT标记的O型FMDV VLP的表征
通过蔗糖梯度离心和Western印迹证实，HiBiT标记的蛋白存在于含有衣壳蛋白的VLP组分中。透射电镜观察显示，纯化的VP4-HiBiT VLP保持了相对完整的颗粒形态，而VP1 GH-HiBiT VLP则出现了组装缺陷和结构异常。
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使用猪血清评估基于VP4-HiBiT VLP的NanoBiT中和试验
对15份猪血清的分析显示，该NanoBiT-VNT能够清晰地区分阴性血清和两个不同滴度的阳性血清组。阳性血清组的抑制曲线呈稀释依赖性，且NanoBiT-VNT测定的中和抗体滴度与传统VNT无显著差异，表明其能有效反映中和抗体水平。
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基于VP4-HiBiT VLP的NanoBiT试验与传统VNT的相关性
对66份猪血清样本的分析表明，两种方法测得的中和抗体滴度之间存在极强的正相关性（R2 = 0.9068）。尽管回归斜率小于1（0.7857），表明两者数值并非完全等同，但强相关性支持该NanoBiT-VNT可作为评估疫苗诱导的中和抗体反应的可靠替代平台。
讨论总结与结论翻译
讨论总结： 研究人员指出，尽管VP1 GH-HiBiT VLP的原始发光信号更强，但其结构异常导致非特异性抑制增加，不适合用于中和试验。相比之下，VP4-HiBiT VLP保留了更完整的颗粒形态，并产生了可重复的、稀释依赖性的中和反应，因此VP4是更适合的插入位点。这强调了在不同FMDV血清型开发NanoBiT平台时，需要优化插入位点以平衡报告信号强度与VLP结构完整性。该NanoBiT-VNT相比传统VNT具有时间短（数小时 vs. 48-72小时）、无需活病毒和高等级生物安全设施的优势，更适合高通量筛查。然而，研究也指出了局限性，如未评估与其他血清型的交叉反应性、未完全排除可溶性蛋白或破碎颗粒对信号的贡献，以及在标准化生产、批间质量控制和分析验证方面仍需进一步工作。
结论翻译： 本研究证明了基于VP4-HiBiT VLP的NanoBiT试验在评估猪血清中针对O型FMDV的中和抗体反应方面的可行性。该试验与传统VNT的强相关性支持其作为功能性抗体评估替代方法的潜力。进一步的验证，包括评估试验精密度、重现性和分析范围，以及使用其他FMDV血清型和特征明确的血清组进行评估，将有助于确立其更广泛的实用性。这些发现支持了VP4-HiBiT/NanoBiT系统作为中和抗体评估替代平台的可行性，但仍需进一步的机制研究来确定试验信号在多大程度上特异性地反映了完整的VLP依赖性细胞进入。
