免疫应答聚焦于 preF 与 GCR 的单周期 RSV 活疫苗

《Viruses》：A Live Single-Cycle RSV Vaccine with Immune Responses Focused on Prefusion F and the Central Conserved Region of Attachment Protein G

　　

呼吸道合胞病毒（RSV）是婴幼儿严重下呼吸道疾病的主要原因，且尚无儿童可用疫苗。在多种技术路线中，活疫苗因可诱导广泛多抗原免疫应答，并且在未感染RSV儿童中从未与疫苗增强性疾病（vaccine-enhanced disease，VED）相关，因而具有吸引力。研究人员此前报道了一种表达融合前F蛋白（prefusion F，preF）的单周期（single-cycle）RSV活疫苗，该病毒缺失细胞-细胞传播能力，但仍可在小鼠中诱导保护性应答。为提高效力，研究人员将抗附着糖蛋白G（attachment protein G）的应答聚焦于相对保守的G中央区域（G central region，GCR）。抗GCR抗体已被证明可在不同RSV毒株间提供交叉保护，并且GCR含有受体结合域（receptor-binding domain，RBD）。聚焦GCR是通过将G开放阅读框（open reading frame，ORF）替换为展示GCR的杂合蛋白ORF实现的，同时保留稳定的preF表达。所得病毒RSV-preF-GCR可在互补细胞中稳定生产，在感染细胞表面表达preF和GCR，并维持单周期表型。在小鼠中，鼻腔内初免-加强免疫可诱导血清抗preF抗体和中度水平的抗G抗体，且抗G抗体特异性针对GCR。RSV-preF-GCR还显著降低了野生型RSV攻毒后的肺部病理改变。然而，与表达全长G的疫苗相比，RSV-preF-GCR诱导抗体的体外中和能力较差，并且肺部免疫球蛋白A（IgA）应答意外偏低。因此，RSV-preF-GCR有望独特地结合单周期复制限制与抗preF和抗GCR双重免疫诱导，但仍可能需要提升效力，以增强抗G抗体水平并诱导黏膜免疫。

RSV是全球常见呼吸道病原，可在婴幼儿、老年人和免疫受损人群中导致严重下呼吸道感染；现有获批疫苗主要靶向融合蛋白F（F）并用于老年人或母婴保护，尚无儿童疫苗。历史上FI-RSV曾诱发疫苗增强性疾病（vaccine-enhanced disease，VED），其机制涉及Th₂偏倚应答；活疫苗在未感染RSV儿童中未见VED，并可诱导多抗原体液、细胞和黏膜免疫。单周期（single-cycle）疫苗缺少一种在互补细胞中反式提供的关键功能，可在细胞内表达抗原但不产生可传播子代。此前preF（prefusion F）单周期疫苗可保护小鼠，但效力仍需提高。G附着糖蛋白（attachment protein G）侧翼区高度变异，而G中央保守区（G central region，GCR）相对保守，且含受体结合域（receptor-binding domain，RBD）CX₃C和肝素结合域（heparin-binding domain，HBD）。抗GCR抗体可跨株保护，并可能促使Th₂向Th₁偏移。因此，研究人员将G开放阅读框（open reading frame，ORF）替换为展示GCR的Fstem/GCR-208A，构建RSV-preF-GCR，以聚焦抗G应答并保留preF免疫。

主要技术方法：研究人员利用反向遗传学从RSV cDNA回收病毒，并在GP64/F互补细胞中制备单周期病毒；通过细胞表面ELISA和免疫印迹检测感染细胞及病毒颗粒中preF、G或Fstem/GCR表达；以GFP示踪评估Vero和Vbac细胞中的细胞-细胞传播；采用8周龄雌性BALB/c小鼠（每组5只）进行鼻腔内初免-加强，并以ELISA检测血清免疫球蛋白G（IgG）和肺匀浆免疫球蛋白A（IgA）；使用RSV-HRP开展体外中和；以RSV-K191R攻毒，经苏木精-伊红（H&E）染色由病理医师盲法评分，并用单因素方差分析（one-way ANOVA）比较。

3.1 蛋白与病毒构建体概览及单周期RSV疫苗生成：构建结果说明，RSV-preF-GCR将GCR展示于preF病毒中，RSV-preF-G208A保留全长膜结合G作为对照。

3.2 感染细胞蛋白表达与病毒颗粒组成：细胞ELISA显示三种病毒在感染细胞表面preF和G水平相当；免疫印迹显示RSV-preF-GCR病毒颗粒无全长G，仅含Fstem/GCR-208A，且GCR融合蛋白水平高于对照病毒中的全长G。

3.3 RSV-preF-G208A和RSV-preF-GCR不向邻近细胞扩散：Vero细胞中GFP信号未扩散，证明二者维持单周期限制，而互补细胞可支持病毒生产。

3.4 抗体诱导：血清IgG ELISA显示RSV-preF-GCR诱导较强抗preF和抗postF（postfusion F）抗体，抗G显著高于RSV-preF，但低于此前RSV-rWT；RSV-preF-G208A抗G很低。

3.5 RSV-preF-GCR诱导的抗G抗体特异于GCR：诊断病毒细胞ELISA显示RSV-preF-GCR血清识别表达GCR的细胞而不识别缺失GCR的细胞，说明抗G应答聚焦于GCR。

3.6 病毒中和：RSV-HRP中和实验显示RSV-preF-GCR血清中和弱于RSV-preF-G208A；RSV-preF-G208A接近RSV-rWT并优于RSV-preF。

3.7 肺IgA诱导：肺匀浆IgA检测显示，两种单周期病毒肺IgA均低于RSV-rWT；RSV-preF-GCR未诱导显著抗G或F IgA。

3.8 攻毒保护：RSV-K191R攻毒病理评分显示，RSV-preF-GCR显著降低肺部炎症，但保护不优于RSV-preF-G208A；RSV-rWT保护最强。

讨论指出，GCR聚焦在理论上可改善跨株保护并减少针对高度变异侧翼区的非中和抗体，但本实验中抗GCR血清IgG尚未达到高水平，体外中和也较弱。作者认为中和不足可能与HBD介导的细胞非特异性进入干扰检测有关，未来需建立不依赖肝素的原代气道上皮细胞中和体系并提高抗GCR抗体。RSV-preF-G208A相对RSV-preF的中和提升提示L208A可能减少组织蛋白酶L切割，但也可能使C端变异区抗体更突出，从而增加株系特异性风险。攻毒保护未随抗GCR抗体增加而改善，可能受肺IgA偏低制约；单周期病毒未诱导肺IgA，作者认为可能与依赖GP64进入的细胞谱、抗原呈递或固有免疫模式不同有关，也可能需要细胞间传播参与IgA诱导。研究结论：RSV-preF-GCR是一种有前景的单周期RSV活疫苗，能同时诱导preF与GCR特异性抗体并减轻肺部病理；但其体外中和和黏膜免疫不足，后续需增强抗GCR抗体水平并改善肺IgA应答。