《Viruses》：Cryo-EM Structure of Siphophage Avs-1 Reveals a Conserved Virion Architecture with a Specialized Tripod-like Tail Tip for Host Recognition
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噬菌体日益被视为控制水产养殖病原体抗生素的可行替代方案，然而虹彩噬菌体感染水生细菌的结构基础在很大程度上仍未得到探索。本研究展示了感染淡水养殖病原体维罗纳气单胞菌（*Aeromonas veronii*）的虹彩噬菌体Avs-1的近原子分辨率冷冻电镜结构。衣壳重
噬菌体日益被视为控制水产养殖病原体抗生素的可行替代方案，然而虹彩噬菌体感染水生细菌的结构基础在很大程度上仍未得到探索。本研究展示了感染淡水养殖病原体维罗纳气单胞菌（*Aeromonas veronii*）的虹彩噬菌体Avs-1的近原子分辨率冷冻电镜结构。衣壳重构达到2.98 ?，刺突结构达到3.58 ?，揭示了一种在lambda样虹彩噬菌体（lambda-like siphophages）中广泛保守的病毒粒子架构，包括HK97折叠（HK97-fold）的衣壳、典型的门户-颈部复合体（portal–neck complex），以及由约26个堆叠的六聚体环构成的尾管（tail tube）。然而，远端尾部尖端表现出显著的特化，装配成一个由远端尾蛋白、毂蛋白、插入蛋白和带尺蛋白C端共同形成的C3对称三脚架样核心。三聚体刺突蛋白gp43从该平台延伸，采用β-螺旋支架，并含有一个结构发散性远端结构域（D4），凸显了噬菌体尾尖架构的结构多样性。综上所述，这些结果揭示了高度保守的病毒粒子框架与多样化远端尾部装置相结合的方式，拓展了对已表征虹彩噬菌体的结构库，并为研究噬菌体-宿主相互作用的分子基础提供了框架。
**一、研究背景与目的**
随着水产养殖环境中抗菌药物耐药性日益严峻，靶向水产病原体（如维罗纳气单胞菌）的噬菌体被认为是传统抗生素的可行替代方案。噬菌体感染周期由其尾部装置启动，该装置是一个多功能机器，协调宿主识别、细胞包膜穿透和病毒基因组递送。在虹彩噬菌体中，远端尾部尖端构成主要吸附机器，包含决定宿主特异性的受体结合蛋白和尾刺。然而，虹彩噬菌体识别并结合水生细菌宿主的结构基础在很大程度上仍然未知。已对感染陆生病原体的虹彩噬菌体进行了广泛结构表征，揭示了尾部尖端的保守架构框架及其外周受体结合组分的显著多样性，β-螺旋尾刺蛋白是常见的受体相互作用支架。然而，感染水产病原体的噬菌体的高分辨率结构仍然稀缺，且水生细菌的细胞表面特性（如脂多糖和胞外多糖层的组成与结构可塑性）与陆生病原体差异显著，表明源自陆生噬菌体模型的结构见解可能无法直接推广至水生噬菌体。维罗纳气单胞菌是一种主要的淡水养殖病原体，造成全球重大经济损失，因此成为此类结构研究的关键目标。研究人员在前期工作中分离并表征了靶向维罗纳气单胞菌的烈性虹彩噬菌体Avs-1，并获得了其主要结构区域的初步冷冻电镜重构，但其结构模块组织和多样化的分子基础仍不清楚。据此，本研究旨在通过高分辨率冷冻电镜结构和原子模型构建，解析Avs-1病毒粒子的完整结构框架，并阐明其远端吸附系统的特化机制。
**二、研究内容与主要结论**
研究人员在前期分离的Avs-1基础上（菌株来源：维罗纳气单胞菌AV1212，培养基为Luria–Bertani肉汤，30 °C培养），进行了独立的噬菌体增殖与纯化。通过冷冻电镜单颗粒分析技术，获得了衣壳（2.98 ?）、颈部（3.12 ?）、尾管（3.30 ?）、尾尖（3.62 ?）和刺突区域（3.58 ?）的近原子分辨率密度图，并利用ModelAngelo和Coot构建了主要结构蛋白的原子模型，包括主要衣壳蛋白gp8、门户蛋白gp6、适配体蛋白gp11、阻遏蛋白gp12、尾终止蛋白gp14、尾管蛋白gp15、远端尾蛋白gp20、毂蛋白gp23、插入蛋白gp21、刺突蛋白gp43以及带尺蛋白gp19的C端区域，经由PHENIX进行实空间精修和验证。研究结果显示，Avs-1病毒粒子总长约2100 ?，尾部约占1430 ?；衣壳采用HK97折叠形成T=7二十面体壳层。门户-颈部复合体包含形成十二聚体通道的门户蛋白gp6，以及适配体蛋白gp11和阻遏蛋白gp12，共同介导衣壳与尾部之间的过渡。尾管由尾终止蛋白gp14起始，包含约26个堆叠的gp15六聚体环，并围绕三聚体带尺蛋白gp19组装。在尾部远端，尾尖核心由远端尾蛋白gp20、毂蛋白gp23、插入蛋白gp21和带尺蛋白C端共同组成，装配成C3对称的三脚架样结构；三聚体刺突蛋白gp43从该平台延伸以介导宿主识别。该结构揭示了保守的虹彩噬菌体尾巴架构与特化的远端吸附系统的结合，为理解噬菌体-宿主互作及虹彩噬菌体远端尾部模块的结构多样性提供了高分辨率框架。
**三、主要技术方法**
该研究采用了以下核心技术方法：（1）冷冻电镜（cryo-EM）数据采集与高分辨率三维重构：利用TOTEM ARM 300s透射电镜配备K3直接电子探测器，在40,000×放大倍数下采集3068张显微照片，使用cryoSPARC v4.6.0软件进行CTF校正、粒子自动挑选、二维分类、从头重构、对称性精修和局部重构，分别获得衣壳、颈部、尾管、尾尖和刺突区域的高质量密度图。（2）原子模型构建与精修：使用ModelAngelo进行自动从头建模，结合Coot进行人工检查与修正，并通过PHENIX进行实空间精修；对于密度不足的区域，采用AlphaFold3预测全长模型作为结构参考，并利用DALI进行结构相似性搜索与比较。（3）结构域注释与比较分析：参照lambda、DT57C、NF5、GVE2、CBA120、P22等已表征噬菌体的结构域命名体系进行功能域划分和进化保守性评估。
**四、主要研究结果**
**4.1 Avs-1噬菌体整体结构。** 利用冷冻电镜技术获得了Avs-1从头部到尾部尖端各结构区域2.98 ?至3.62 ?的重构密度图，并构建了所有主要结构蛋白的原子模型。Avs-1病毒粒子总长度约2100 ?，尾部约1430 ?；衣壳为HK97折叠的T=7二十面体壳层；门户-颈部复合体由门户蛋白gp6（十二聚体）、适配体蛋白gp11和阻遏蛋白gp12组成；尾管由尾终止蛋白gp14和约26个gp15六聚体环堆叠而成；尾尖核心由gp20、gp23、gp21和gp19 C端形成C3对称三脚架样结构，刺突蛋白gp43从该平台延伸。
**4.2 门户-颈部复合体结构。** 门户蛋白gp6由十二个拷贝组成，位于衣壳独特五重顶点，形成连接衣壳内部与尾管的连续通道，包含wing、stem、clip和crown四个结构域，整体折叠高度保守。适配体蛋白gp11形成十二聚体环，包含附着结构域和α-螺旋束结构域，分别与门户和阻遏蛋白接触。阻遏蛋白gp12形成六聚体环，包含中心β-桶核心、β2-β3环和β-发夹结构域，介导十二重对称到六重对称的转变。
**4.3 尾管结构。** 尾管由六聚体的尾终止蛋白gp14环起始，随后为约26个堆叠的gp15六聚体环。gp14单体包含反向平行β-折叠核心、两个α-螺旋以及O-loop和E-loop，结构与lambda gpU、T5 p142和SPP1 gp17保守。gp15单体包含N端TTP折叠结构域和C端免疫球蛋白样（Ig-like）结构域，TTP折叠构成管主体框架，Ig样结构域则向外突出于管表面。尾管采用右手螺旋架构，相邻环间上升约38.5 ?，扭转约14.8°。
**4.4 尾尖核心结构。** 尾尖核心由DTP gp20、毂蛋白gp23、插入蛋白gp21和TMP gp19 C端组成。gp20位于尾尖近端，β-三明治结构域与尾管远端环相互作用，延伸的α-螺旋结构域与刺突蛋白N端螺旋形成螺旋束以稳定刺突。gp23是与lambda gpJ同源的毂蛋白，包含HDII、HDII插入、HDIII、HDIV、FNIII和远端β-富集结构域，其中多个结构域保守，但远端β-富集结构域呈现出独特的三脚架样组织。gp21与lambda gpL结构相似（DALI Z=11.1），包含N端β-三明治结构域和延伸连接区，但缺乏C端铁结合域。
**4.5 三聚体刺突蛋白结构。** 刺突蛋白gp43形成三聚体，从远端尾蛋白向外延伸；已构建模型涵盖D2、D3和部分D4结构域。D2结构域主要由构成刺突颈部区域的α-螺旋组成；D3结构域采用典型β-螺旋折叠，与GVE2刺突蛋白（Z=7.4）和CBA120 TSP4（Z=8.9）高度相似。相比之下，D4结构域呈现显著结构发散性，突出了尾尖作为虹彩噬菌体结构多样化主要位点的角色。
**五、讨论与结论**
研究讨论指出，Avs-1的门户-颈部复合体和尾管架构与感染陆生病原体的lambda样虹彩噬菌体高度保守，证实了头-尾连接和尾管组装所需的基本结构框架在水生和陆生虹彩噬菌体间的普遍性。然而，尾部远端区域呈现出显著的结构特化：毂蛋白gp23形成了不同于lambda针状尾尖的三脚架样紧凑平台，插入蛋白gp21保留保守的β-三明治核心但缺少lambda gpL的金属结合结构域，刺突蛋白gp43则结合了保守的β-螺旋支架与分化的远端D4结构域。三脚架样核心结构在其他虹彩噬菌体（Chi、JBD30、R4C）中亦有报道，提示该组织模式可能在虹彩噬菌体中具有广泛功能意义。研究人员提出，三聚体刺突可能参与对细菌表面的初始可逆接触，随后通过多个尾尖组分的协调互作实现更稳定的附着。虽然具体受体和功能机制尚待确定，但该研究建立的尾尖与刺突结构框架为探究其在水生环境噬菌体-宿主互作中的潜在角色提供了基础。综上所述，Avs-1将保守的病毒粒子框架与多样化的远端模块相结合，为理解虹彩噬菌体在水产病原体控制中的分子机制和进化策略提供了重要结构依据。
