孕期及哺乳期暴露于全球日均摄入量水平的双酚A（BPA）导致新生和幼年Wistar大鼠后代小胶质细胞状态、基因表达及行为模式的性别依赖性改变

《Life》：Prenatal and Lactation Exposure to Bisphenol A (BPA) at the Global Mean Daily Intake Level Leads to Sex-Dependent Changes in Microglial State, Gene Expression, and Behavioral Patterns in Newborn and Juvenile Wistar Rat Offspring

　　

双酚A（Bisphenol A，BPA）是一种广泛使用的增塑剂，在全球食品工业中应用普遍。然而，目前对于其每日安全摄入量尚未达成共识，且大量数据表明产前BPA暴露与早期神经精神疾病（如自闭症谱系障碍（ASD）和注意缺陷多动障碍（ADHD））之间存在关联。全球平均人体等效BPA剂量估计为30 ng/kg体重/天。因此，本研究以新生和幼年Wistar大鼠两性后代为对象，这些后代来自从妊娠第6天至第21天、并在哺乳期继续21天经口给予30 ng/kg体重/天BPA的母鼠。研究数据表明，从妊娠第6天至分娩的产前暴露于30 ng/kg/天，可诱导新生（PD1）大鼠脑内性别二态性、区域特异性的改变，影响炎症反应、雌激素受体信号传导及神经祖细胞动态。产前BPA处理的雄性表现出促炎状态，其特征为海马中分枝状Iba1⁺小胶质细胞总数增加，同时Aif1、Nfkb、Tnf、Il1b和Hif1a上调。相反，产前BPA处理的雌性仅表现出海马Iba1⁺细胞总数增加，并表现出炎症韧性，缺乏这些标志物的上调。两性均通过上调Nfkb、Tnf、Il1b和Hif1a在前额叶皮质表现出促炎状态。虽然两性在前额叶皮质均表现出Tgfb降低，但它们采用了不同的代偿反应：雄性仅在海马中上调神经保护因子Igf1，而雌性在海马和前额叶皮质中均上调Igf1。雌激素受体表达也呈高度二态性。在海马中，雄性通过Esr1上调和Esr2下调表现出失衡，而雌性仅表现出Esr2下调。在前额叶皮质中，这些转录谱则相反。最后，神经祖细胞标志物发生改变。在前额叶皮质中，BPA驱动雄性Sox2和Pax6上调，而雌性Sox9上调；在海马中，仅雄性Pax6上调。海马中PAX6蛋白水平在雄性中显著升高，在雌性中降低。在幼年后代（PD21）中，以过度探索、环境调查增加以及社交暴露期间情绪反应性增强为特征的行为模式在雌性后代中更为明显。这些新生期基线差异以及随后的行为改变，强调了在评估生命早期神经发育及后续成年期行为和生物学脆弱性时，需要采用性别特异性的方法。

双酚A（BPA）是全球产量最大的增塑剂之一，广泛应用于食品、医疗等行业的塑料制品中。人类通过饮食、饮水等途径持续暴露于BPA，其全球平均每日摄入量估计为30 ng/kg体重。然而，各国监管机构对BPA安全剂量的标准差异悬殊，例如欧洲食品安全局（EFSA）2021年将每日耐受摄入量（TDI）定为0.2 ng/kg，而美国FDA仍允许高达50 μg/kg的日摄入量，中国国标则规定了特定迁移限量。目前缺乏对低剂量BPA影响神经系统发育的充分研究，尤其是针对两性差异的探索。小胶质细胞作为中枢神经系统的固有免疫细胞，在产前神经发生、突触修剪和髓鞘形成中发挥关键作用，其功能异常与自闭症谱系障碍（ASD）、注意力缺陷多动障碍（ADHD）等神经发育疾病密切相关。既往研究多采用远高于环境相关剂量的BPA（0.5–50 mg/kg），且主要关注雄性后代，导致对低剂量BPA性别依赖性效应的认识严重不足。因此，本研究旨在探讨接近人类实际暴露水平的BPA剂量（30 ng/kg/天）在孕期和哺乳期暴露后，对两性后代新生期脑内小胶质细胞状态、炎症信号、雌激素受体表达、神经祖细胞动态以及幼年社交行为的影响。

研究人员将怀孕Wistar大鼠自妊娠第6天至第21天经口给予30 ng/kg体重/天的BPA，并在分娩后哺乳期继续给药至出生后第21天（PD21），分别于新生期（PD1）和幼年期（PD21）对两性后代进行系统分析。研究发现，该极低剂量BPA暴露可诱导母体全身性炎症（血清钙卫蛋白升高），并导致后代脑内出现性别二态性、区域特异性的分子和细胞改变。雄性新生鼠表现为海马促炎性小胶质细胞极化（Aif1、Nfkb、Tnf、Il1b、Hif1a上调）和雌激素受体Esr1/Esr2失衡，而雌性仅表现为海马小胶质细胞总数增加，且炎症标志物无明显上调，但前额叶皮质同样呈促炎状态，并伴随更强的代偿性神经保护反应（Igf1和Sox9上调）。幼年期行为测试显示，两性BPA暴露后均出现过度探索、环境调查增加和社交暴露时理毛行为增多，雌性表现更为突出。这些结果揭示了极低剂量BPA暴露可通过母体免疫激活（MIA）影响后代神经发育，且存在显著性别差异，为理解环境内分泌干扰物在ASD和ADHD等疾病易感性中的潜在作用提供了探索性证据。

本研究采用了多种关键技术方法。动物实验使用从俄罗斯联邦国家生物医学技术中心Stolbovaya分支购买的Wistar大鼠，母鼠随机分为对照组（n=5）和BPA处理组（n=7），BPA溶于0.5%葡萄糖溶液经口灌胃。主要检测方法包括：酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清BPA和钙卫蛋白水平；免疫组织化学（IHC-P）结合形态计量学分析计数海马和脑室周围区Iba1⁺小胶质细胞总数及分枝状/阿米巴状亚型；实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测炎症因子（Nfkb、Tnf、Il1b、Tgfb）、雌激素受体（Esr1、Esr2）、神经祖细胞标志物（Sox2、Sox9、Pax6）等mRNA表达；蛋白质印迹（Western blotting）检测海马PAX6蛋白水平；三箱社交行为测试评估幼年（PD21）后代的社交偏好和探索行为。

**3.1 血清BPA水平在子代间无差异，而钙卫蛋白在BPA处理母鼠中升高**
通过ELISA检测新生子代血清游离BPA浓度，发现对照组与BPA处理组之间无统计学差异，可能因为暴露剂量极低，BPA在母体内被代谢或结合，仅有痕量通过胎盘。但BPA处理的母鼠血清钙卫蛋白显著升高，提示母体存在系统性炎症状态，这可能通过母体免疫激活影响胎儿脑发育。

**3.2 产前BPA暴露以性别依赖性方式改变Iba1⁺小胶质细胞数量和形态及Aif1表达**
免疫组化计数显示，与对照组相比，BPA处理组两性海马中总Iba1⁺细胞数均增加，但仅雄性分枝状小胶质细胞显著增多，雌性无差异。脑室周围区中，BPA处理雄性阿米巴状细胞数量低于对照组雄性。RT-qPCR显示，雄性海马Aif1（编码Iba1）表达较对照组升高近4倍，而前额叶皮质中BPA处理组雄性表达较雌性高约26倍。表明雄性小胶质细胞更倾向于向促炎性分枝状成熟表型转化。

**3.3 产前BPA暴露导致雌激素受体表达在不同脑区呈现差异**
在新生鼠海马中，BPA处理雄性Esr1（ERα）表达较对照组上调2倍，而Esr2（ERβ）仅在处理雌性中下调；前额叶皮质中，两性Esr1均较对照组下降，Esr2则均升高，且这些变化在雄性中呈相反的失衡模式。总体上，BPA处理雄性表现出Esr1/Esr2比值失衡更明显，可能影响雌激素介导的神经保护信号。

**3.4 产前BPA暴露导致两性后代促炎基因和神经保护标志物表达呈单向变化**
RT-qPCR结果显示，海马中雄性Nfkb、Tnf、Il1b上调，雌性仅Il1b上调；前额叶皮质中两性均上调Nfkb、Tnf、Il1b和Hif1a，同时抗炎因子Tgfb表达下降（雄性降3.8倍，雌性降2.6倍）。雌性还出现海马和前额叶Igf1表达上调3倍，而雄性无此变化。提示雄性以促炎为主，雌性通过Igf1等机制表现更强的代偿韧性。

**3.5 产前BPA暴露导致神经祖细胞基因表达和蛋白水平发生性别依赖性改变**
前额叶皮质中，BPA处理雄性Sox2和Pax6表达上调，而雌性Sox9上调；海马中仅雄性Pax6上调。蛋白水平上，雄性海马PAX6蛋白显著升高，雌性反而降低。这些改变提示BPA可能差异性地影响祖细胞增殖与分化方向，雄性偏向神经元分化，雌性偏向星形胶质细胞分化，造成海马神经发生微环境的性二态性改变。

**3.6 幼年后代社交行为模式改变**
三箱社交测试显示，BPA处理的两性幼年鼠在中央空箱和陌生鼠箱中站立（rearings）次数显著增多，在陌生鼠箱中理毛（grooming）次数也增加。雌性后代还表现出进入中央箱和熟悉鼠箱次数及停留时间增加，雄性则在陌生鼠箱中停留时间显著大于熟悉鼠箱。这些行为变化提示过度探索、环境调查增加和社交暴露时情绪反应性增强，且雌性尤为明显。

讨论部分指出，极低剂量BPA可能通过诱导母体慢性低度炎症（MIA）而非直接经胎盘传递来影响胎儿脑发育。小胶质细胞形态改变（雄性分枝状增多）可能反映其从阿米巴状向成熟监视表型过早转变，进而影响突触修剪和神经祖细胞池的维持。雌激素受体Esr1/Esr2的失衡可能干扰雌激素介导的神经保护与抗炎信号，增加神经精神疾病易感性。前额叶皮质中促炎基因上调和Tgfb下调共同构成促炎微环境，而雌性通过Igf1和Sox9的上调显示出更强的适应性反应。幼年行为表型（过度探索、理毛增多）与ADHD模型中的多动和冲动表型有一定重叠，但属于探索性结果，尚不能确认为ASD样社交缺陷。研究局限性包括未检测子代血清BPA精确浓度、仅观察新生期和幼年期单一时间点、行为范式较窄且缺乏非社交对照、以及炎症标志物仅停留在mRNA水平。结论认为，极低剂量BPA产前和哺乳期暴露可能通过母体免疫激活和小胶质细胞性别依赖性改变，为子代建立促炎性神经发育背景，并导致幼年期探索和情绪反应行为改变，这些变化在雌性中更为突出，提示在评估早期生命神经发育和成年期行为脆弱性时，必须采取性别特异性研究策略。本研究为低剂量BPA暴露与神经发育障碍风险之间的潜在关联提供了探索性证据。