采收后管理下的微生物风土：连接风干工艺与科维纳葡萄微生物组及代谢组动态

《Fermentation》：Microbial Terroir Under Post-Harvest Management: Linking Withering Practices to Grape Microbiome and Metabolome Dynamics in Corvina Grapes

　　

摘要 与葡萄相关的微生物群落是葡萄酒品质和微生物风土的关键贡献者，然而，它们在风干（withering）过程中的动态变化——这一对优质甜酒和加强酒生产至关重要的采收后阶段——至今仍缺乏系统研究。研究人员采用高通量宏条形码技术（metabarcoding，分别基于16S rRNA和ITS区域），监测了科维纳（Corvina）葡萄浆果在受控（C）与非受控（NC）两种风干条件下整个风干过程中的细菌和真菌群落，并将微生物组数据与此前测定的挥发性有机化合物（volatile organic compounds, VOCs）及芪类化合物（stilbenes）谱相整合，以揭示分类群与代谢物之间的关联。微生物群落在脱水过程中经历了逐步的结构重组。此外，两种风干条件表现出不同的脱水动力学特征，受控条件下达到30%失重率比非受控条件提前14天，且对多个与酿酒相关及腐败相关的类群丰度产生显著影响。其中，Metschnikowia在受控条件下于10%和20%失重率时显著更为丰富，而Botrytis在非受控条件下于30%失重率时相对丰度达到26.5%，相比之下受控条件下仅为2.4%。相关网络分析识别出Lactobacillus、Acinetobacter、Clostridium等属与代谢物积累之间的显著关联，其中Metschnikowia与生物活性化合物呈正相关，而与腐败真菌呈负相关。这项首次对风干过程中真菌组、细菌组动态及代谢组变化进行联合时间序列分析的研究，强调了微生物演替与葡萄生化变化之间的显著关联。

一、研究背景与科学问题

葡萄果实表面栖息着高度多样化的微生物群落，这些附生微生物被称为“微生物风土”（microbial terroir），对葡萄健康、果实品质及最终葡萄酒的风格特征具有深远影响。以往研究已广泛关注葡萄生长季和成熟期果实表面微生物群落的组成与演替，但对采收后关键工艺阶段——尤其是风干（withering）过程中微生物群落的动态变化知之甚少。风干是生产多种世界知名甜型及加强型葡萄酒（如Amarone、Vin Santo、Pedro Ximénez等）的核心前置工艺，葡萄在特定环境中脱水至约30%失重率，此过程中果实发生强烈的生化转化，直接影响成酒品质。然而，现有研究多聚焦于风干过程的工艺参数优化和代谢物变化，缺乏对微生物群落演替及其与代谢物关联的系统性认识。此外，不同风干系统（受控与非受控）对微生物群落的影响尚不明确。基于上述空白，研究人员提出三个假设：（i）葡萄果际微生物群落在风干过程中经历逐步重组；（ii）这些微生物变化与芪类化合物及挥发性有机化合物等品质相关代谢物的变化相关联；（iii）不同风干系统对细菌和真菌群落产生差异化影响。本研究旨在通过时间序列分析阐明微生物动态对葡萄采收后生化演变的贡献，深化对优质葡萄酒生产中微生物风土作用的理解。

二、研究设计与主要技术方法

研究在意大利瓦波利切拉（Valpolicella）产区开展，以用于生产Amarone葡萄酒的科维纳（Corvina）品种为对象，跨越2016和2017两个年份。葡萄采自两个不同土壤特性的葡萄园（Colombaia和Quaiara），分别置于受控（C，塑料箱+风扇控湿）和非受控（NC，传统木架自然通风）两种工业规模风干系统中。在风干起始（0%失重率）及10%、20%、30%失重率四个时间点采样，共获得56份样本。主要技术方法包括：基于16S rRNA V3-V4区和ITS2区域的高通量扩增子测序（Illumina MiSeq平台）解析细菌和真菌群落组成；DADA2流程进行序列质控和特征变体鉴定；QIIME2平台进行生物信息学分析；RDP和UNITE数据库分别用于细菌和真菌分类学注释；PERMANOVA评估环境因子对群落结构的影响；基于Bray-Curtis距离的非度量多维尺度分析（NMDS）可视化β多样性；Cytoscape平台结合CoNet插件构建微生物-代谢物共现网络，采用Pearson相关系数评估关联强度。

三、研究结果

3.1 风干过程中葡萄微生物组的演变

在细菌群落方面，风干全程共鉴定出9个细菌纲，其中β-变形菌纲（Betaproteobacteria）始终为优势类群（T0时占84.92%），其次为鞘脂杆菌纲（Sphingobacteria）和α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）。属水平共记录143个属，Cupriavidus为最丰富属（T0占39%），虽在T20降至12%，但T30回升至30%。Pedobacter从T0的16.3%持续下降至T20的0.18%。值得关注的是，乙酸菌Gluconobacter在T20达到12.9%后回落至T30的约1%，而乳酸菌Lactobacillus在T30出现（0.6%）。

在真菌群落方面，座囊菌纲（Dothideomycetes）始终为优势类群（占65%-80%以上）。属水平共记录176个属，Aureobasidium为最丰富属（全程占28%-56%），Alternaria和Cladosporium次之。Botrytis从T0的4.11%降至T10的0.9%，随后急剧上升至T30的14.48%。与酿酒相关的Hanseniaspora、Starmerella和Metschnikowia在新鲜果实上几乎不可检测（0.1%-0.5%），但在风干过程中显著增长至3%-5%。部分属（如Wallemia、Vishniacozyma、Bettsia）仅在风干后期出现。

3.2 不同风干系统对葡萄果际微生物组的影响

受控条件（C）达到30%失重率比非受控条件（NC）提前14天。细菌方面，两处理间多数优势属无显著差异，仅少数低丰度属（如Brevundimonas、Bradyrhizobium、Acetobacter等）在特定时间点存在显著差异。梭菌纲（Clostridia）在T20时NC显著高于C，而几丁质噬菌纲（Chitinophagia）在T30时C显著高于NC。

真菌方面差异更为显著。T10时，Aureobasidium、Starmerella、Hanseniaspora、Botrytis和Metschnikowia在C中显著高于NC，而Alternaria、Cladosporium、Penicillium、Pithomyces和Aspergillus在NC中更丰富。T30时，NC条件下Botrytis相对丰度达26.5%，为C条件（2.4%）的十倍以上；Wallemia和Penicillium亦在NC中显著更高。C条件下Aureobasidium（48.8%）、Alternaria（16.8%）、Epicoccum和Filobasidium显著高于NC。

3.3 代谢组与微生物组的关系

芪类化合物方面，24个细菌属与至少一种芪类化合物呈正相关，包括Rhodococcus与顺式云杉苷、Acinetobacter和Lactobacillus等与δ-葡萄素、Clostridium等与反式ε-葡萄素、Brevibacterium等与反式白藜芦醇。真菌中Metschnikowia与δ-葡萄素和反式白藜芦醇共现，Wallemia与反式ε-葡萄素、Penicillium与反式白藜芦醇呈正相关。相反，Pedobacter、Undibacterium和Achromobacter不仅与多种芪类化合物呈负相关，还分别与31、36和16个其他细菌属呈互斥关系。挥发性有机化合物方面，Flavisolibacter和Streptococcus与苯系物、呋喃类和单萜类正相关，Pedobacter与所有VOCs均呈互斥关系。真菌中Armillaria与脂肪醇正相关，Kabatiella和Psathyrella与单萜类正相关。值得注意的是，Metschnikowia与包括Penicillium在内的六个属呈互斥关系，而有害真菌Fusarium和Botrytis分别与五个和三个属（含Penicillium）呈正相关。

四、讨论与结论

讨论部分指出，本研究所鉴定的微生物类群均曾在葡萄浆果、叶片或汁液中被报道。细菌群落以环境广泛分布的类群为主，与Salvetti等人在科维纳风干葡萄中的发现（以γ-变形菌纲为主）不同，本研究以β-和α-变形菌纲为主，可能源于葡萄园叶际或风干房环境的微生物输入。Cupriavidus和Burkholderia等属具有促生和生防潜力，而Pedobacter的消失可能与其耐旱性差有关。真菌方面，Aureobasidium作为优势属具有公认的生防活性。Botrytis在NC条件下T30的显著增长值得关注，但结合视觉评估和化学分析（苯甲醛相对苯甲醇含量低），研究人员推测其可能以贵腐（noble rot）形式存在而非灰霉病。Metschnikowia在C条件下显著更高，其已知的抗菌活性和产酶能力对风干过程具有积极意义。微生物-代谢物关联分析提示，微生物诱导的生物胁迫可能激活芪类化合物生物合成；Pedobacter、Undibacterium和Achromobacter的广泛互斥关系可能反映其生防能力，但也可能是对葡萄生物胁迫响应的敏感性所致。研究结论强调，风干过程中细菌和真菌群落均发生部分重组，不同风干系统显著影响微生物群落结构，且微生物组与葡萄品质相关代谢物的变化密切相关。这体现了微生物风土概念在采收后阶段的重要性，微生物与代谢物之间的关联应视为反映宿主-微生物持续互作的双向关系。研究同时指出，宏条形码技术仅提供群落组成信息，无法直接评估微生物代谢活性、存活状态或功能基因表达，未来研究应深入探究所观察关联背后的机制。