《mAbs》：Discovery and engineering of bispecific TCR-mimic antibodies targeting peptide–HLA complex
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TCR模拟（TCRm）抗体代表着癌症免疫治疗中一个颇有前景的新领域，使得那些先前被认为无法用抗体进行靶向的细胞内靶点变得可及。研究人员开发了一个集成化平台，用于产生模拟T细胞受体（TCR）并以高特异性和高亲和力识别肽–HLA复合物的人源抗体。这些抗体结合分子随
TCR模拟（TCRm）抗体代表着癌症免疫治疗中一个颇有前景的新领域，使得那些先前被认为无法用抗体进行靶向的细胞内靶点变得可及。研究人员开发了一个集成化平台，用于产生模拟T细胞受体（TCR）并以高特异性和高亲和力识别肽–HLA复合物的人源抗体。这些抗体结合分子随后被工程化为高效双特异性抗体，能够重定向T细胞以杀伤肿瘤细胞。通过利用高质量的pHLA免疫原、全人源转基因小鼠、先进的单B细胞发现技术以及全蛋白质组脱靶筛选（X-Scan）技术，这一端到端平台为TCRm抗体的发现确立了新的基准。在本研究中，研究人员重点展示了靶向Wilms肿瘤1（WT1）抗原的抗体的成功鉴定与工程化改造，并显示出优于同类竞争性TCRm抗体的性能。
**研究背景与目的**
单克隆抗体（mAb）疗法是肿瘤治疗的重要支柱，但传统抗体只能靶向细胞表面或分泌蛋白，而细胞表面抗原仅占蛋白质组的约30%，大量与肿瘤相关的胞内蛋白无法被常规抗体触及。胞内蛋白可经蛋白酶体降解为肽段，并由人类白细胞抗原（HLA）I类分子呈递到细胞表面，形成肽–HLA（pHLA）复合物。T细胞受体（TCR）能够识别这些pHLA复合物，但TCR直接用于治疗存在交叉反应风险高、分离筛选效率低、亲和力低且需亲和力成熟等局限。TCR模拟（TCRm）抗体可模拟TCR识别pHLA，同时具有更高的亲和力，并可被工程化为双特异性T细胞衔接器。已有靶向pHLA的双特异性TCR药物如tebentafusp和IMC-F106C展现出临床前景。针对以上问题，研究人员建立了一套完整的TCRm抗体发现与工程化平台，并以WT1
126–134/HLA-A*02:01为概念验证靶点，获得了高特异性、高亲和力的TCRm抗体，并将其改造为具有强效抗肿瘤活性的双特异性抗体。该研究证明了TCRm抗体能够实现类似TCR的特异性，为免疫疗法触及胞内“不可成药”靶点提供了新路径。
**主要关键技术方法**
主要技术方法：①由Immunitrack制备的WT1
126–134/HLA-A*02:01单体免疫ATX-GK全人源转基因小鼠（n=12）；②FACS分选WT1四聚体阳性、对照pHLA阴性的IgG+记忆B细胞并单细胞测序，同时构建噬菌体Fab文库经负选/正选淘选；③Carterra SPR测亲和力，T2细胞肽脉冲结合试验、噬菌体pHLA panel和X-Scan全蛋白质组脱靶扫描评估特异性；④将TCRm Fab与抗CD3 scFv（DM38或UCHT1来源）组装为Knob-in-Hole非对称双特异性抗体，含N297A效应沉默或抗HSA半衰期延长域，用Jurkat报告细胞和原代CD8+ T细胞杀伤试验验证。样本：TF-1（ATCC）、SET-2（DSMZ）经DepMap数据库选择，健康供者PBMC来自STEMCELL Technologies。
**研究结果**
**抗体多样性生成及pHLA结合子的筛选**
研究人员用WT1
126–134/HLA-A*02:01单体免疫ATX-GK小鼠，所有小鼠均产生针对该pHLA复合物的免疫应答。通过FACS分选WT1四聚体阳性且阴性对照pHLA阴性的IgG+记忆B细胞，WT1特异性B细胞占IgG+记忆B细胞的0.5%–6.5%。共克隆95个阳性hit，代表78个独特重链CDR3；ELISA鉴定出11%的抗体特异性结合WT1
126–134/HLA-A*02:01，而不结合混合肽/HLA-A*02:01，对应3个独特克隆型。免疫噬菌体文库经三轮负选/正选淘选，又获得15个特异性抗体，对应2个克隆型。
**抗WT1
126–134/HLA-A*02:01 TCR模拟抗体特异性结合WT1
126–134/HLA-A*02:01**
26个特异性抗体经Carterra SPR检测，对WT1
126–134/HLA-A*02:01单体的亲和力在10
-7～10
-10 M之间，其中25个不结合MAGE-A4/HLA-A*02:01等阴性对照。表位分型实验将抗体分为两个主要表位类别。T2细胞肽脉冲结合实验显示，所有抗体均结合WT1肽脉冲的T2细胞，但26个抗体中有8个不结合高同源脱靶肽M13L和PIGQ，而对照抗体33H9、ESK1和11D06对一种或两种脱靶肽有结合。进一步对内源性表达WT1和HLA-A*02的SKM-1细胞结合实验确认，前8个候选抗体特异性结合SKM-1细胞，对不表达HLA的K562细胞和不表达WT1的T2细胞结合极弱。结合EC50为0.181～1.02 nM。
**TCRm抗体特异性检测**
研究人员开发了基于噬菌体展示的特异性检测方法，用约40种pHLA三聚体进行ELISA，未发现可疑脱靶信号；随后用包含172种单氨基酸替换的单链pHLA噬菌体文库进行X-Scan分析，经两轮淘选和NGS测序生成相互作用表位图谱。SeqLogo数据将9个TCRm抗体分为4个表位亚群：亚群1（ATX-TCRm-06）识别WT1肽的5个位置；亚群2（ATX-TCRm-01、-03、-04）识别4个位置，与33H9类似；亚群3识别3个位置；亚群4（11D06、ESK1）对多个位置突变耐受性较高。全人蛋白质组同源搜索显示，ATX-TCRm-06等亚群仅以WT1
126–134肽为潜在结合靶点，而11D06和ESK1可能与4～12条其他肽存在潜在相互作用。基于该特异性结果，研究人员选择ATX-TCRm-06进行双特异性抗体工程化。
**双特异性抗体工程化与功能表征**
第一种双特异性抗体将ATX-TCRm-06的Fab臂与抗CD3 scFv（
