从活性污泥中分离与筛选潜在的三卤甲烷抗性细菌及其耐受性评估

《Water》：Isolation and Tolerance Screening of Potential Trihalomethane-Resistant Bacteria from Activated Sludge

　　

三卤甲烷（Trihalomethanes, THMs）是致癌的消毒副产物，对环境与健康构成严重威胁，然而，具备THMs抗性的有效微生物候选物仍未被充分探索。在本研究中，研究人员从一个制药废水处理厂的活性污泥中分离出十二种不同的细菌菌株，以识别潜在的THMs抗性细菌。这些分离株被鉴定、评估其生长速率，并在暴露于30和50 mg/L混合THMs的矿物盐琼脂培养基中，进行了为期72小时的耐受性筛选。筛选结果显示，其中四种菌株，即BFMZ、EFMZ、FFMZ和IFMZ，表现出卓越的恢复力，在高浓度THMs（50 mg/L）胁迫下仍能维持+2至+5的细胞生长评分，而其他菌株的生长则受到抑制。通过16S rDNA测序和系统发育分析的分子鉴定确认，这些耐受菌株分别为Tsukamurella sp.分离株BFMZ（评分+5）、Klebsiella sp.分离株EFMZ（评分+3）、Bacillus sp.分离株FFMZ（评分+2）和Bacillus sp.分离株IFMZ（评分+4）。值得注意的是，尽管分离株BFMZ的生长速度中等，但在高THMs胁迫下表现出最强的生理恢复力。这些发现突显了THMs抗性细菌的潜力，并为去除顽固性消毒副产物提供了有前景的候选菌株。

论文解读文章

一、研究背景与意义

三卤甲烷（Trihalomethanes, THMs）是一类已知具有致癌、遗传毒性和肝毒性等特性的消毒副产物（Disinfection By-Products, DBPs），主要包括氯仿（CHCl₃）、一溴二氯甲烷（CHCl₂Br）、二溴一氯甲烷（CHClBr₂）和三溴甲烷（CHBr₃）。长期接触THMs与膀胱癌、出生缺陷和流产等不良健康效应密切相关。因此，各国监管机构均设定了严格的饮用水THMs浓度限值，如美国环保署（USEPA）设定总THMs限值为80 μg/L，欧盟则为100 μg/L。然而，许多水处理厂，特别是在发展中国家，难以稳定达到这些标准。

传统的THMs去除方法，如曝气、吸附和高级氧化工艺（Advanced Oxidation Processes, AOPs），往往成本高昂，且对低分子量化合物或特定水质条件下的去除效果有限。例如，颗粒活性炭（Granular Activated Carbon, GAC）对低分子量THMs前体物的吸附效果不佳；而短期曝气无法持续降低THMs水平，尤其在溶解性有机碳含量高的水体中。近期研究表明，某些微生物群落能在特定条件下降解THMs，例如硝化细菌中的Nitrosomonas europaea和Nitrosomonas oligotropha。然而，现有研究多使用未经鉴定的混合菌群，关于特定THMs抗性细菌的分离与鉴定研究仍相对匮乏。因此，本研究的首要目标是分离、筛选并鉴定能够在THMs存在下生长的潜在细菌菌株，旨在为开发基于微生物的水质改善策略提供科学依据。

二、主要技术方法

研究人员采用了以下关键技术方法：

1. 1.
   细菌分离与纯化：从马来西亚雪兰莪州一家制药工业废水处理厂的活性污泥池采集样品，通过十倍梯度稀释和涂布平板法在营养琼脂平板上分离出形态各异的单菌落，并经多次划线纯化获得纯培养物。
2. 2.
   形态学与生化鉴定：对纯化的分离株进行菌落形态观察、革兰氏染色和过氧化氢酶试验等初步表征。
3. 3.
   THMs抗性筛选：将菌株接种于含有30 mg/L和50 mg/L混合THMs的矿物盐培养基（Mineral Salt Medium, MSM）中，在37°C、150 rpm条件下振荡培养72小时。定期取样涂布营养琼脂平板，根据菌落生长情况评分，以此评估菌株的THMs耐受性。
4. 4.
   分子生物学鉴定：提取高生长评分菌株的基因组DNA，利用通用引物27F和1492R扩增16S rDNA基因片段并进行测序。将获得的序列与NCBI数据库进行BLAST比对，并通过邻接法构建系统发育树，确定菌株的分类学地位。

三、研究结果

3.1 分离细菌

共从活性污泥中分离出12株细菌。所有分离株均为过氧化氢酶阳性，表明其具备分解过氧化氢的能力。革兰氏染色结果显示，除EFMZ和JFMZ两株为革兰氏阴性菌外，其余10株均为革兰氏阳性菌，表明该活性污泥样品中以革兰氏阳性菌为主导。

3.2 细菌生长速率

研究人员通过测定生物量干重和光密度（Optical Density, OD₅₅₀）两种方法计算了各菌株的比生长速率（μ）。基于生物量的生长速率范围为0.0565 h^-1（HFMZ）至0.0782 h^-1（DFMZ），而基于OD的生长速率普遍较高，范围为0.1368 h^-1（JFMZ）至0.1935 h^-1（AFMZ）。研究指出，OD测量因对细胞浊度变化更敏感，通常给出更高的表观生长速率，但无法区分活细胞与死细胞，因此在应用时需谨慎。

3.3 THMs抗性细菌的筛选

在50 mg/L的高浓度THMs暴露下，大多数菌株（如AFMZ、CFMZ、DFMZ等）在48小时后无可见菌落生长，显示出THMs对其强烈的细胞毒性作用。然而，有四株菌——BFMZ、EFMZ、FFMZ和IFMZ——表现出显著的抗性，在72小时后仍能维持高于20%的生长评分。其中，BFMZ菌株获得了最高的+5分生长评分，几乎覆盖了整个琼脂平板，表明其拥有强大的适应性反应。值得注意的是，虽然EFMZ具有最高的生物量比生长速率，但其THMs耐受性并非最强，这表明快速增殖能力并非决定其在THMs胁迫下长期存活的关键因素，而BFMZ虽生长较慢，却展现了最强的生理恢复力。

3.4 潜在THMs生物降解菌的鉴定

通过16S rDNA测序和系统发育分析，最终鉴定出这四株高耐受性菌株的身份：BFMZ与Tsukamurella sp.相似度为96%；EFMZ与Klebsiella sp.相似度为97%；FFMZ和IFMZ均被确认为Bacillus sp.。研究进一步讨论了这些属在环境生物修复中的作用，如Tsukamurella spp.可降解复杂烃类，Klebsiella spp.能消除氯化有机物，而Bacillus spp.以其抗氧化能力和产生生物表面活性剂而著称。

四、讨论与结论

讨论总结：研究强调，仅依赖生长速率或生物量积累（如OD值）作为生物降解潜力的指标存在固有缺陷。在卤代化合物环境中，微生物的存活和活性依赖于复杂的解毒和应激响应机制。因此，未来的筛选方法应超越简单的生长测量，纳入基于细胞活力（如CFU计数）、酶活性测试以及气相色谱-质谱联用（GC-MS）代谢物谱分析等参数。后者能通过鉴定降解中间体和终产物，直接证明THMs的转化。将遗传特性与生理功能相结合的综合方法是确保筛选出不仅能耐受THMs，更能有效降解THMs的菌株的关键。

研究结论翻译：在本研究中，四株细菌——T. inchonensis（BFMZ）、K. quasipneumoniae（EFMZ）、B. subtilis（FFMZ）和B. methylotrophicus（IFMZ）——成功地从制药废水中分离出来，并且所有这些菌株都对高浓度的THMs表现出高度抗性，相比其他分离株具有更好的生长性能。凭借+2至+5的筛选评分，这些菌株被认为是用于生物去除THMs的有效候选者，而大多数其他细菌则无法在这种环境下生存。这些发现为受THMs污染的废水提供了一种有前景的生物辅助手段，以补充传统的化学处理方法。未来的工作将致力于在受控和实际条件下量化这些菌株的THMs抵抗能力，通过分子和代谢谱分析阐明其降解途径，并在中试规模或基于生物膜的处理系统中比较它们的性能。此类研究对于推进工业废水中THMs减排的可持续和有效解决方案至关重要。