柬埔寨与老挝蜜蜂属物种中蜜蜂病毒及蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）的基线检测

《Insects》：Baseline Detection of Honey Bee Viruses and Nosema ceranae in Apis Species from Cambodia and Laos

　　

蜜蜂在自然和农业生态系统中提供重要的授粉服务，然而关于柬埔寨和老挝蜜蜂相关病原体的信息却十分有限。本研究利用PCR和RT-PCR检测技术，对来自10个地点的53个蜂群进行了筛查，其中包括东方蜜蜂（Apis cerana，n=28）、西方蜜蜂（A. mellifera，n=18）、大蜜蜂（A. dorsata，n=4）和小蜜蜂（A. florea，n=3），以检测常见的蜜蜂病毒和微孢子虫（Nosema ceranae）。结果在东方蜜蜂和西方蜜蜂中检测到6种病毒——急性蜜蜂麻痹病毒（acute bee paralysis virus）、黑蜂王台病毒（black queen cell virus）、变形 wing 病毒A型（deformed wing virus type A）、以色列急性麻痹病毒（Israeli acute paralysis virus）、克什米尔蜜蜂病毒（Kashmir bee virus）和湖西奈病毒（Lake Sinai virus）——以及N. ceranae，各检测位点的总体检出频率较低。在大蜜蜂或小蜜蜂中未检测到任何目标病原体；然而，这些物种的样本量有限，限制了对未检出结果的解释。部分基因片段序列与先前报道的亚洲分离株具有相似性，表明与已知的区域病毒多样性一致。这些发现为柬埔寨和老挝的蜜蜂相关病原体提供了基线检测数据，并支持需要通过扩大宿主物种和季节的采样范围，以更好地描述该地区病原体的流行情况。

**研究背景与问题**
蜜蜂（Apis属）在全球自然与农业生态系统中承担着关键授粉功能。长期以来，蜂群健康备受关注，但全球范围内管理蜂群数量并未呈现一致下降趋势，部分欧洲和北美地区却出现冬季蜂群损失加剧的现象。这类损失受生物、环境、管理和社会经济等多因素交互影响。在生物胁迫因子中，外寄生螨（Varroa destructor）显著改变了蜜蜂病毒病的流行格局，其不仅是蜂群健康的直接威胁，更是多种RNA病毒的高效传播媒介和扩增载体。变形翼病毒（Deformed wing virus, DWV）是最常与瓦螨侵染相关的病毒之一，其复合群包含多个主要变异型。微孢子虫属的蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae）也常见于蜂群，但其感染与蜂群死亡率的关联尚存争议。在亚洲，尤其在引入西方蜜蜂（Apis mellifera）与本地东方蜜蜂（Apis cerana）共存的区域，病毒检出频率在不同宿主和季节间存在差异。然而，柬埔寨和老挝作为湄公河区域的一部分，其蜜蜂相关病原体的公开数据极为稀缺。尽管该区域分布有管理或野生的东方蜜蜂、西方蜜蜂、大蜜蜂（Apis dorsata）和小蜜蜂（Apis florea），此前尚无针对这些宿主物种的系统病原学调查。因此，本研究旨在通过靶向分子检测，初步明确柬埔寨和老挝多个采样点蜂群中常见蜜蜂病毒和微孢子虫的存在情况，为后续监测和保护提供基线数据。

**研究内容与主要结论**
研究人员从柬埔寨5个地点（Sisophon、Battambang、Siem Reap、Phnom Penh、Ratanakiri）和老挝5个地点（Oudomxay、Vientiane、Luang Prabang、Nabong、Thong Pong）共采集53个蜂群样本，涵盖四种蜜蜂物种，其中东方蜜蜂28群、西方蜜蜂18群、大蜜蜂4群、小蜜蜂3群。采用常规PCR和两步RT-PCR技术，对10种RNA病毒和6种DNA病原体进行筛查。结果显示，共检出6种病毒和N. ceranae：急性蜜蜂麻痹病毒（ABPV）、黑蜂王台病毒（BQCV）、变形翼病毒A型（DWV-A）、以色列急性麻痹病毒（IAPV）、克什米尔蜜蜂病毒（KBV）、湖西奈病毒（LSV）以及N. ceranae。所有阳性检出均来自东方蜜蜂或西方蜜蜂，未在大蜜蜂和小蜜蜂中检测到目标病原体，但这两类蜂的样本量极小（共7群），无法据此确认病原体不存在。序列比对和系统发育分析确认了检测目标的身份，并显示其与亚洲及全球已有参考序列高度相似。国家层面的描述性比较显示，老挝检出的病毒种类（5种）和多重病毒共检蜂群数（4群）高于柬埔寨（2种病毒，1群多重共检），ABPV为两国共有病毒，DWV-A仅在柬埔寨的西方蜜蜂中检出。这些结果提供了该区域首个针对多种蜜蜂宿主的病原基线数据，支持未来开展更广泛和重复采样的监测工作。

**关键技术方法**
研究采用的主要技术方法包括：（1）线粒体细胞色素c氧化酶亚基I（COI）DNA条形码技术，通过PCR扩增和Sanger测序确认所有蜂群的物种身份；（2）常规PCR和两步RT-PCR，分别用于检测DNA病原体（如N. ceranae）和RNA病毒（先逆转录为cDNA再扩增）；（3）阳性扩增子的Sanger测序与基于最大似然法的系统发育分析，对检测到的病毒和N. ceranae进行身份确认和参考序列比较。样本采集自柬埔寨（2022年5月和2023年7月）和老挝（2022年5月和2023年3月），每群至少采集50只工蜂，保存于RNAlater中，随后运至泰国清迈大学实验室处理。

**研究结果**
- **COI条形码鉴定**：53个蜂群（100%）的COI条形码扩增成功，序列比较确认所有形态学鉴定无误，四种Apis物种的分子身份得到验证。
- **病原体检出频率与病毒共检模式**：共检出7种目标病原体（6种病毒和N. ceranae），阳性检出均局限于东方蜜蜂和西方蜜蜂。柬埔寨检出的病毒组合包括3个仅DWV-A单病毒蜂群和1个ABPV与DWV-A双病毒蜂群；老挝检出1个仅BQCV蜂群、1个ABPV和IAPV双病毒蜂群、2个BQCV和LSV双病毒蜂群、1个ABPV、IAPV和KBV三病毒蜂群。多病毒共检在老挝占17.4%（4/23），在柬埔寨占3.3%（1/30）。
- **序列比较与片段系统发育**：Sanger测序确认了所有目标阳性扩增子的身份。系统发育分析显示，ABPV序列与来自中国和捷克共和国的参考序列聚为一支；BQCV序列与亚洲参考序列聚为一支并形成独立分支；DWV-A序列全部来自柬埔寨西方蜜蜂，与越南和中国的DWV-A参考序列聚在一起，且明显区别于DWV-B/VDV-1参考序列；IAPV序列与中国、俄罗斯、波兰和韩国参考序列聚为一支；KBV序列与亚洲KBV参考序列聚为一支；LSV序列与LSV4组参考序列聚为一支；N. ceranae序列与来自中国、台湾、摩洛哥、泰国、日本、法国和美国的参考序列聚在N. ceranae进化枝内，且柬埔寨Siem Reap的东方蜜蜂和西方蜜蜂序列完全相同。

**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究是首个针对柬埔寨和老挝多种Apis物种进行蜜蜂相关病毒和N. ceranae分子调查的报告。检测到的病毒均为亚洲及全球养蜂业中已知的常见病原，其在东方蜜蜂和西方蜜蜂中的出现与其广泛宿主范围一致。DWV-A仅在柬埔寨西方蜜蜂中检出，可能与瓦螨在该宿主中的病毒扩增作用有关，但本研究中未评估瓦螨侵染情况，因此无法分析其关联。老挝的病毒种类和多重检出率较高，可能反映宿主组成、管理方式、地理、采集时间或环境条件差异，但样本量不均限制了统计推断。大蜜蜂和小蜜蜂未检出任何目标，可能与开放巢居或迁徙生态、寄生虫关联差异、采样量小等因素有关。研究局限性包括宿主样本量不均、采样时间有限、缺乏标准化蜂群健康/强度/管理数据、靶向面板未覆盖全部病原、以及常规RT-PCR仅为定性检测。结论强调，该研究提供了区域病原基线数据，但需扩大宿主和季节采样范围，结合标准化蜂群评估、瓦螨检测和更长基因组序列，才能更全面了解湄公河区域蜜蜂病原生态。

**研究结论翻译**
本研究针对柬埔寨和老挝多个地点的蜂群进行了靶向基线调查，在采样的东方蜜蜂和西方蜜蜂蜂群中检出了ABPV、BQCV、DWV-A、IAPV、LSV、KBV和N. ceranae，且总体检出频率较低。在少量采样的A. dorsata和A. florea蜂群中未检出任何目标病原体，但样本量有限和时间覆盖不足限制了对其病原缺失的推断。PCR扩增子的测序确认了目标身份，并显示其与先前报道的参考序列具有相似性，支持广泛的区域病毒亲缘关系。由于分析基于部分基因片段，系统发育结果被保守解释，不用于推断传播途径或流行病学动态。未来需要开展扩大和纵向的调查研究，以更全面地描述湄公河区域蜜蜂种群中病原体的发生和多样性。