基于重组人XVII型胶原蛋白的可注射光交联水凝胶通过激活TGF-β/SMAD信号通路促进骨软骨再生

《BIOMATERIALS RESEARCH》：An Injectable and Photocrosslinkable Hydrogel Based on Recombinant Human Collagen Type XVII Promotes Osteochondral Regeneration by Activating the TGF β/SMAD Signaling Pathway

　　

关节软骨缺损的管理仍是重大临床挑战，原因在于该组织固有的再生能力有限。基于传统胶原蛋白的水凝胶常因生物学功能与力学性能不匹配而难以实现功能性修复。本研究首次将重组人XVII型胶原蛋白（rhCOL17）应用于软骨修复，构建了一种基于rhCOL17的可注射光交联水凝胶。通过系统性筛选，研究确定了15%甲基丙烯酰化rhCOL17（CMA）配方具有最优的力学性能与生物相容性，其具备适宜的三维多孔结构、适度的溶胀率、缓慢降解能力以及快速原位光交联特性。体外实验表明，CMA水凝胶无细胞毒性，并能显著促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）和软骨细胞的增殖、迁移及成软骨分化，表现为SOX9、COL2和ACAN表达上调。在体内，采用大鼠膝关节全层软骨缺损模型，负载BMSCs的15% CMA复合水凝胶（BMSCs@CMA）实现了优异的骨软骨整合修复，再生组织在宏观形态、软骨下骨矿化、组织学结构及II型胶原沉积方面与天然软骨高度相似。机制上，转录组测序、分子对接及分子动力学模拟共同证明，rhCOL17能与转化生长因子-β1（TGF-β1）高亲和力直接结合并形成稳定相互作用，进而激活TGF-β/SMAD信号通路，调控BMSCs成软骨分化。综上，本研究确立了XVII型胶原蛋白在软骨再生中的关键作用，提出了一种兼具力学适应性和主动诱导功能、可用于功能性软骨缺损修复的微创策略，并拓展了rhCOL17的跨组织应用前景。

一、研究背景与意义

关节软骨缺损常由急性创伤、慢性退行性关节疾病及年龄相关退变引起，导致持续关节疼痛和进行性运动功能障碍，最终发展为不可逆的终末期骨关节炎。由于软骨组织缺乏血管、淋巴和神经支配，且细胞外基质代谢周转极慢，其内在自我修复能力极为有限。目前临床上常用的微骨折术和自体软骨细胞移植等疗法虽能暂时缓解症状，但再生组织多为纤维软骨，力学性能差，且存在长期退变和整合不良等问题。可注射水凝胶因能精准填充不规则缺损、实现微创递送并构建仿生微环境而成为研究热点。其中，基于胶原的水凝胶与天然ECM高度仿生，在生物相容性、可控降解性和营养渗透性方面具有优势。然而，传统I型胶原水凝胶常出现表面劈裂、纤维化及与周围软骨整合差等问题；无机陶瓷或导电聚合物复合胶原材料多依赖高温固化或有毒光引发剂，且缺乏内源性成软骨信号，只能提供被动机械支撑。因此，亟需开发兼具力学适应性、主动生物功能和优异组织整合能力的胶原基支架材料。XVII型胶原蛋白（COL17）虽在皮肤中作为半桥粒核心成分被熟知，但其组织界面维持、干细胞巢调控和细胞信号转导等功能恰好对应软骨修复中支架-组织整合差、种子细胞分化调控不足等痛点。然而天然组织中COL17含量极低，提取纯化困难。重组人XVII型胶原蛋白（rhCOL17）保留了天然COL17核心活性片段，具有高纯度、低免疫原性和批次一致性可控等优点。同时，软骨缺损区自身骨髓间充质干细胞（BMSCs）数量不足且活性低，直接植入存在滞留率低、存活不足和分化不可控等问题。因此，将rhCOL17功能特性与水凝胶载体优势结合，构建负载BMSCs的复合水凝胶，有望通过“材料支架-种子细胞-生物信号”协同实现软骨缺损修复。

二、研究内容与主要结论

研究人员设计并构建了基于rhCOL17的甲基丙烯酰化（CMA）可注射光交联水凝胶，系统优化其力学性能和生物相容性，筛选出15% CMA配方。体外实验证实该水凝胶无细胞毒性，并能显著促进BMSCs和软骨细胞增殖、迁移及成软骨分化，上调SOX9、COL2、ACAN表达。在大鼠膝关节全层软骨缺损模型中，负载BMSCs的15% CMA复合水凝胶（BMSCs@CMA）实现了优异的骨软骨整合修复，再生组织在宏观形态、软骨下骨矿化、组织学结构和II型胶原沉积方面接近天然透明软骨。机制研究表明，rhCOL17可直接结合TGF-β1，激活TGF-β/SMAD信号通路，从而调控BMSCs成软骨分化。该研究首次将rhCOL17引入软骨修复系统，明确了其在软骨再生中的核心调控作用，为功能性软骨缺损修复提供了微创、力学可适应且具有主动诱导功能的新策略，拓展了rhCOL17在再生组织工程中的跨组织应用前景。

三、主要关键技术与方法

该研究采用以下关键技术：（1）通过甲基丙烯酸酐修饰rhCOL17合成CMA，利用405 nm紫外光交联构建可注射水凝胶，并利用核磁共振（1H NMR）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和飞行时间质谱（TOF-MS）表征改性效果；（2）材料性能表征包括扫描电镜（SEM）观察微观结构、流变学和压缩试验测定力学性能、溶胀及酶降解实验评估降解行为；（3）细胞实验采用EdU增殖、活/死染色、Transwell迁移、CCK-8活性及RT-qPCR检测成软骨基因表达；（4）动物实验使用SD大鼠膝关节全层软骨缺损模型（股骨滑车沟，直径2.0 mm、深度1.0 mm），分为空白对照组、15% CMA组、BMSCs@CMA组和假手术组，术后12周取材，通过大体观察、micro-CT、组织学染色和免疫组化评估修复效果；（5）机制研究运用转录组测序（RNA-seq）、分子对接（HDOCK）和100 ns全原子分子动力学模拟（GROMACS）结合MM/GBSA和MM/PBSA计算结合自由能，验证rhCOL17与TGF-β1的分子相互作用。

四、研究结果

1. CMA水凝胶的制备与表征

通过MA与rhCOL17氨基反应成功将甲基丙烯酰基接枝到胶原骨架上，TOF-MS显示分子量从23801 Da增至24378 Da，FTIR在950-1000 cm^-1出现C=C特征峰，1H NMR在1.8、2.8和5.5 ppm出现新峰，MA接枝效率为33.64%。不同浓度（5%、10%、15%）CMA前体溶液与光引发剂LAP混合后在405 nm紫外下快速固化成胶。压缩测试显示15% CMA压缩模量达39.32 kPa，约为5% CMA（1.86 kPa）的20倍；流变测试显示15% CMA储能模量最高（1013.62 Pa）。SEM显示15% CMA具有孔径约45.33 μm、孔隙率74.40%的三维多孔结构。溶胀实验显示15% CMA平衡溶胀率（32.84%）低于10% CMA（39.21%）。酶降解实验显示15% CMA完全降解需约180 h，优于10% CMA的102 h。因此筛选15% CMA为最优配方。

2. CMA水凝胶体外促进BMSCs增殖、迁移和成软骨分化

EdU实验显示10%和15% CMA组BMSCs EdU阳性比例显著高于传统2D培养对照组；活/死染色显示各组活细胞比例均>95%；Transwell实验显示CMA对BMSCs具有趋化作用，迁移细胞数显著增加；CCK-8显示CMA组细胞活力持续高于对照组，15% CMA在第7天促增殖作用最强；流变时间扫描显示15% CMA在前3天维持高G′（8000-9000 Pa），第7-14天降至600-700 Pa，表明可早期提供稳定力学环境后期可控降解。RT-qPCR显示CMA培养7天后BMSCs中SOX9、COL2、ACAN mRNA表达显著上调，15% CMA组效果优于10% CMA组。

3. CMA水凝胶体外维持软骨细胞表型和合成活性

EdU实验显示CMA显著促进原代软骨细胞增殖，15% CMA组EdU阳性比例高于10% CMA组；活/死染色验证了良好细胞相容性；Transwell迁移实验显示15% CMA组迁移细胞数显著多于10% CMA组；CCK-8显示15% CMA组各时间点OD值更高；RT-qPCR显示软骨细胞中SOX9、COL2、ACAN表达显著上调，15% CMA组上调幅度更大。

4. CMA水凝胶体内促进软骨缺损修复

将BMSCs@CMA复合水凝胶注入大鼠膝关节全层软骨缺损（直径2.0 mm、深度1.0 mm），术后12周大体观察显示BMSCs@CMA组缺损几乎完全填充，表面光滑并与周围软骨整合良好；ICRS宏观评分显著高于空白对照组和15% CMA组。micro-CT显示BMSCs@CMA组软骨下骨形成连续完整骨填充，灰度值接近正常骨组织，骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）均显著高于对照组和CMA组，与假手术组无显著差异。

5. 组织学评估

H&E染色显示BMSCs@CMA组形成与假手术组相似的层次结构，含典型软骨细胞簇；改良O'Driscoll组织学评分显著高于对照组和CMA组，与假手术组无显著差异。SO&FG染色显示BMSCs@CMA组强阳性，大量GAG沉积，阳性面积率与假手术组相当。Masson染色显示BMSCs@CMA组形成连续有序的蓝染胶原基质层。COL2免疫荧光和免疫组化一致显示BMSCs@CMA组COL2阳性信号强，阳性面积率与假手术组相当，表明修复组织具有透明软骨关键基质特征。

6. 转录组测序机制分析

RNA-seq共鉴定3124个差异表达基因（1349个上调、1775个下调）。KEGG富集显示成软骨分化、ECM相互作用和细胞黏附通路显著富集，其中TGF-β信号通路为核心调控通路。GSEA证实CMA组TGF-β信号通路显著激活。热图显示TGFBR2、SMAD3/4、BMP2等核心基因在CMA组上调。PPI网络确认TGFBR2、SMAD3、SMAD4、BMP2、BMP4、BMP5为主要枢纽。RT-qPCR验证了TGFBR2、SMAD3、SMAD4、BMP2表达上调，与测序结果一致。

7. rhCOL17与TGF-β的分子相互作用

分子对接显示rhCOL17与TGF-β1通过氢键和疏水作用形成特异性结合界面。100 ns分子动力学模拟显示复合物RMSD稳定在0.2-0.4 nm，核心结合区RMSF显著降低，回转半径和溶剂可及表面积稳定，表明复合物构象收敛、结构紧凑且不解离。能量分析显示总结合自由能为-47.8 kcal/mol，范德华力和静电相互作用是主要驱动力，残基能量分解与对接关键位点高度一致。

五、讨论与结论总结

研究人员指出，尽管CMA水凝胶在大鼠模型中取得满意修复效果，但大鼠软骨较薄、自修复能力较强、ECM代谢快且关节力学负荷低，结果不能直接外推至大型动物和人类负重关节。CMA水凝胶的力学模量和降解速率仅适配大鼠关节腔微环境，需针对人体软骨力学需求和修复周期进行参数优化。此外，体内观察周期较短，缺乏长期追踪数据。未来研究计划包括开展大型动物骨软骨缺损修复实验、延长观察周期评估再生软骨长期持久性、优化配方以缩小基础研究与临床应用差距。临床创伤性和退变性骨软骨缺损常存在持续炎症微环境，CMA水凝胶的多孔结构可物理吸附过量炎症细胞因子，改善局部炎症应激，后续将定量评估其在不同炎症条件下的细胞因子吸附能力，并可作为抗炎药物缓释平台。总之，本研究首次将rhCOL17应用于关节软骨缺损修复，成功构建了可注射光交联CMA水凝胶，筛选出15% CMA为最优配方，其保留了rhCOL17核心结构和生物活性，具备适合关节微环境的力学性能、三维多孔网络、适度溶胀、可控降解和快速原位光交联能力。体外证实其优良生物相容性并促进BMSCs和软骨细胞增殖、迁移和成软骨分化；大鼠模型中BMSCs@CMA实现了稳健的骨软骨整合修复，再生组织接近天然透明软骨。机制上证明rhCOL17直接结合TGF-β1并激活经典TGF-β/SMAD信号通路，协调BMSCs成软骨分化，实现“材料支架-种子细胞-生物信号”一体化修复模式。该工作为功能性软骨缺损修复提供了微创、力学可适应、具主动诱导功能的新策略，并为rhCOL17在再生组织工程中的跨组织应用奠定了基础。