基于数据库衍生的邻苯二甲酸酯–强直性脊柱炎特征识别AP-1/CXCL8炎症性经典单核细胞程序

《Genes》：A Database-Derived Phthalate Ester–Ankylosing Spondylitis Signature Identifies an AP-1/CXCL8 Inflammatory Classical-Monocyte Program

　　

目的：研究人员检验了数据库衍生的邻苯二甲酸酯（PAE）–强直性脊柱炎（AS）候选基因集是否能够识别一种炎症性转录程序，并刻画了其转录因子（TF）结构。方法：采用机器学习优先级排序和重复嵌套交叉验证，随后将锁定模型从GSE73754迁移至GSE25101。供体水平的单细胞分析包含来自10名AS患者和29名健康对照供体的96,746个外周血单个核细胞（GSE194315），并在另外25名基线AS患者（GSE277117）中进行了印证评估。结果：在经典单核细胞中，连续特征与排除基因集外的TNF-α/NF-κB信号（ρ = 0.571；q = 0.000729）、炎症反应（ρ = 0.447；q = 0.0108）以及10个AP-1相关TF活性中的8个存在共变。排除靶基因后的TF活性与CXCL8（8/10）和IL1B（10/10）共变。AP-1基因/CXCL8共表达在额外AS队列中获得部分印证（JUN–CXCL8：ρ = 0.92）。在从473个共享候选基因中优先排序的16个基因中，CXCL8、IL2RB、STAT5B和TNF稳定。锁定的14基因模型受试者工作特征曲线下面积为0.770（DeLong 95%置信区间，0.596–0.943），支持部分秩可迁移性。次要分析显示，AS中自然杀伤（NK）细胞的CD56bright比例较低（?2.699个百分点；95%置信区间，?4.575至?0.611；q = 0.0498），且NK细胞JUN表达降低（log2倍数变化 = ?0.995；校正后p = 0.0497）。结论：PAE–AS特征识别出AP-1/CXCL8相关的经典单核细胞炎症程序，并具有部分跨队列印证和次要NK改变，为暴露知情机制研究提供了候选靶点。

**数据库衍生的邻苯二甲酸酯–强直性脊柱炎特征识别AP-1/CXCL8炎症性经典单核细胞程序：研究解读**

**1. 研究背景与问题**

强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis, AS）是一种慢性免疫介导的炎症性疾病，以中轴炎症、关节外表现和进行性结构损伤为特征。先天免疫激活以及TNF和IL-17相关炎症通路已被确立为疾病发病机制的重要组成部分，且AS具有强遗传基础。然而，与AS炎症异质性相关的循环免疫细胞程序仍未完全阐明。邻苯二甲酸酯（phthalate esters, PAEs）是广泛用于消费品增塑剂等用途的合成化学品。实验研究表明，多种PAEs及其代谢物可改变单核细胞/巨噬细胞系统中的先天免疫反应：在分化的THP-1巨噬细胞样细胞中，邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）增加包括IL-8/CXCL8在内的炎症介质产生，并促进NF-κB p65核转位；在人外周血单个核细胞培养中，邻苯二甲酸二乙酯（DEP）、邻苯二甲酸二正丁酯（DBP）和邻苯二甲酸单正丁酯可改变细胞因子分泌；母鼠交配前至断奶期间暴露于邻苯二甲酸丁苄酯可增加后代小鼠胶原诱导关节炎的易感性和严重程度。这些发现为在免疫介导疾病中检查PAE相关免疫程序提供了依据。然而，毒理基因组学和靶点预测资源中与PAEs相关的基因是否汇聚于AS相关的特定循环免疫细胞炎症程序，仍不清楚。单核细胞是合理的候选细胞，因其整合先天感知和细胞因子扩增功能，且单细胞研究已发现AS中疾病相关的髓系细胞改变。

**2. 研究目的与设计**

研究人员整合公共批量转录组数据集与外周血单个核细胞单细胞图谱，检验数据库来源的PAE–AS重叠特征是否与循环炎症状态相关，并评估跨队列一致性和细胞定位。研究使用了GSE73754、GSE25101、GSE299639、GSE194315和GSE277117等公共数据集，这些队列均未包含直接的PAE或代谢物测量，因此PAE–AS特征被定义为数据库衍生的转录构建体而非暴露生物标志物。

**3. 主要关键技术方法**

研究首先构建PAE–AS候选基因集：对7种常见PAEs（DMP、DEP、DiBP、DBP、DEHP、DiNP、DnOP）的化学结构信息，利用Comparative Toxicogenomics Database（CTD）、PharmMapper和SwissTargetPrediction预测人源靶点，并与GeneCards和OMIM中AS相关基因取交集，获得473个共享候选基因。随后在GSE73754队列（52例AS，20例健康对照）中，采用随机森林、LASSO和XGBoost三种机器学习算法进行特征重要性排序，取至少两种算法排名前20的基因作为共识基因（16个），并在GSE25101和GSE299639两个额外队列中进行单基因可分性和内部交叉验证。锁定模型分析将GSE73754训练的14基因L1惩罚逻辑回归模型原样应用于GSE25101。单细胞分析方面，对GSE194315（10例AS、29例健康对照，共96,746个外周血单个核细胞）进行质量控制、Harmony批次校正、聚类和细胞类型注释，提取单核细胞亚群（经典、中间、非经典），计算每个细胞的PAE–AS特征评分。使用AUCell计算Hallmark通路模块活性，pySCENIC重建转录因子调节子网络，decoupler单变量线性模型（ULM）推断转录因子活性。供体水平分析采用伪bulk方法（DESeq2、Wilcoxon配对检验等），以避免单细胞伪重复问题。额外AS队列GSE277117（25例基线AS患者）用于AP-1基因/CXCL8共变关系的部分印证。

**4. 主要研究结果**

**4.1 数据库交集产生473个炎症富集候选基因**
AS相关基因集包含2456个基因，7种PAEs相关或预测靶基因并集包含3580个基因，交集得到473个共享候选基因。功能富集分析显示这些基因主要富集于炎症反应、细胞因子–细胞因子受体相互作用、NF-κB信号、TNF信号和IL-17信号通路，表明其与广泛的NF-κB/TNF/IL-17炎症环路存在重叠，但不建立PAE特异性。

**4.2 四个基因稳定，锁定模型可迁移性有限**
在GSE73754训练队列中，通过三种机器学习算法交叉共识，获得16个共识基因：ADAMTS4、STAT5B、COMMD7、CXCR4、TGFB1、OLFML3、MEFV、IL2RB、IL1R1、TMEM258、ALPP、TNF、CXCL8、ITGAL、PDGFRB和STAT3。通过100次重复分层五折外循环评估选择频率，其中4个基因被分类为稳定：CXCL8（选择频率0.722）、IL2RB（0.852）、STAT5B（0.994）和TNF（0.740）。锁定14基因模型在GSE25101中获得AUC 0.770（DeLong 95%CI 0.596–0.943），在冻结阈值0.443下敏感度0.562、特异度0.812，Brier评分0.241，校准斜率0.443，表明仅部分秩可迁移性。

**4.3 供体水平评分未优先定位于经典单核细胞**
在GSE194315的23,401个单核细胞中，未发现任何主要谱系或单核细胞亚群在AS与健康对照间存在显著的连续评分差异（BH校正后）。经典单核细胞中AS与健康对照的标准化均差为0.096，Hedges’ g为0.558（95%CI ?0.208至1.407；p = 0.182；q = 0.364）。基于三分位的描述性分析显示AS组特征高评分细胞比例较高（48% vs 28%；p = 0.038），但校正后的连续分析无统计学意义。

**4.4 经典单核细胞特征与炎症通路共变**
在排除特征基因后，连续CD14单核细胞评分与TNF-α/NF-κB信号（ρ = 0.571；q = 0.000729）和炎症反应（ρ = 0.447；q = 0.0108）显著相关，且在校正疾病分组后仍存在。供体水平模型中，1085个基因与评分相关（BH校正后），年龄/性别校正后降至997个，进一步技术批次校正后为104个。

**4.5 特征与推断的AP-1/即早转录因子模块共变**
pySCENIC分析显示，CXCL8和IL1B共享相同的10个排名最高的候选转录因子（AP-1为中心的即早/应激反应模块：JUN、JUNB、JUND、FOS、FOSB、ATF3、EGR1、KLF4、KLF6、NR4A2）。供体水平连续分析中，10个预设TF活性中有8个与特征显著相关：JUN、JUND、JUNB、FOS、FOSB、ATF3、EGR1、KLF6，其中JUND关联最强（ρ = 0.576；q = 0.00127）。存档的配对高/低特征比较显示所有10个TF的Hodges–Lehmann差异均为正。但10个TF活性在AS与健康对照间均无显著差异。

**4.6 AP-1/CXCL8共变在额外AS队列中获得部分印证**
在39个供体水平的单核细胞伪bulk分析中，排除靶配体后，10个TF活性中有8个与CXCL8共变，10/10与IL1B共变，7/10与TNF共变，无一与HLA-E共变。年龄/性别/批次校正后，6个CXCL8和7个IL1B关联仍存在，但TNF关联均不存续。在额外AS队列GSE277117中（25例基线AS，无健康对照），JUN–CXCL8共表达强（ρ = 0.92），而JUND–CXCL8弱（ρ = ?0.05），提示仅部分AS内印证而非AS特异性调控程序的重复。

**4.7 NK细胞发现为次要且主要为组成性改变**
供体水平伪bulk DESeq2分析显示，细胞合并检验中出现的“效应解离”表型（细胞毒性转录本PRF1、GZMB、NKG7增加，IFNG/GNLY降低）在供体水平均未达到显著（所有校正后p ≥ 0.17）。选定的NK基因中仅有JUN达到供体水平显著，在AS中表达降低（DESeq2 log2FC = ?0.995，95%CI ?1.553至?0.437，p = 4.77×10??，校正后p = 0.0497）。供体水平组成分析显示AS供体CD56bright NK细胞比例较低（?2.699个百分点；95%CI ?4.575至?0.611；q = 0.0498），常规NK比例较高（+3.035个百分点；q = 0.0498），总NK比例无显著差异。供体水平AP-1发散评分（Z_JUN ? Z_JUNB）在HC中为轻度JUN优势（均值+0.071），在AS中转为JUNB优势（均值?0.226；Mann–Whitney p = 9.6×10?3）。CollecTRI数据库中IFNG、GNLY、CD69、FASLG被注释为JUN而非JUNB的靶基因，而GZMB、TNF和CCL5为JUN/JUNB共享靶标。

**5. 讨论与结论总结**

讨论部分指出，该研究将数据库来源的PAE–AS特征与供体水平经典单核细胞中的炎症通路和推断的AP-1活性相关联。AP-1相关活性与CXCL8和IL1B共变，AP-1基因/CXCL8共变在额外AS队列中获得部分AS内印证。然而，校正后的连续特征评分和检测的TF活性在AS与健康对照间无显著差异，因此不能建立AS特异性程序。NK区的发现为次要细胞背景。研究存在若干局限性：PAE–AS重叠基因集是计算推断而非基于实测暴露反应，故其对PAE的特异性未确立；所有队列均无PAEs或其代谢物测量；供体水平样本量（n=39，10例AS）限制统计功效；临床元数据不完整；横断面设计无法推断疾病起始与后果。未来研究应配对定量邻苯二甲酸酯代谢物与AS和对照队列的纵向单细胞分析，并直接通过靶向扰动实验检验候选AP-1/CXCL8关系及蛋白水平读数。

结论部分翻译：数据库衍生的PAE–AS特征在供体水平CD14经典单核细胞图谱中识别出AP-1/CXCL8相关的炎症程序，该程序与广泛炎症通路共变，并在AS内获得AP-1基因/CXCL8共表达的部分印证。较低的相对CD56bright NK细胞丰度和降低的NK细胞JUN表达提供了次要免疫背景。